重組豬干擾素α6在畢赤酵母中表達及其活性研究

鐘穎 牛婷 代洪波

摘要：為獲得穩定表達重組豬α6干擾素的畢赤酵母。人工合成PoIFN-α6基因片段，連接至pPICZαA質粒，構建PoIFN-α6畢赤酵母表達質粒pPICZαA-PoIFNα6；經SacI酶線性化后轉化至畢赤酵母X33感受態細胞，篩選陽性克隆；優化畢赤酵母表達條件，并對表達產物進行了體外抗病毒活性測定。結果表明，成功構建了表達重組豬α6干擾素的畢赤酵母，以1%甲醇誘導72 h后，菌體上清SDS-PAGE可見20 kDa左右目的條帶，Western blot檢測為陽性；表達的重組豬干擾素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系統中均具有良好的抗病毒活性。說明PoIFN-α6在細胞上清中表達成功，并且在不同宿主細胞中均有抗病毒活性。

關鍵詞：干擾素，重組豬干擾素α6，畢赤酵母，抗病毒活性

中圖分類號：S859.1 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2018）08-0005-03

近幾年，豬瘟、豬偽狂犬病、豬流行性腹瀉、豬繁殖與呼吸綜合征等病毒性傳染病在各大小型養殖場流行，給養豬業帶來了巨大的經濟損失[1，2]。而針對病毒性疫病尚無特效藥物進行治療。研究表明干擾素（IFN）是一類由單核細胞和淋巴細胞產生具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節功能的糖蛋白[3-5]。干擾素I型（尤其是IFN-α、IFN-β）因其生物活性，成為了目前研究最廣的細胞因子之一[6，7]，到目前為止，尚未有重組豬干擾素α（Porcine interferon-α，PoIFN-α）類生物制劑上市。PoIFN-α包含17個家族蛋白，不同蛋白間氨基酸高度同源，均有良好的抗病毒活性[8]。PoIFN-α對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、水皰性口炎病毒、流行性腹瀉病毒等引起的疫病有良好的預防與治療效果[9-13]。此外，PoIFN-α還有免疫調節作用，Razzuoli等[14，15]發現，口服低劑量的PoIFN-α可以有效預防仔豬斷奶期應激，增強仔豬的免疫抵抗力。

分泌型畢赤酵母表達載體pPICZαA，內含高效的啟動子醇氧化酶（AOX1）、多克隆位點、分泌信號肽α、線性化酶切位點、抗性篩選標記和組氨酸標簽等，是高效分泌表達、檢測、純化外源蛋白的常用載體[16]。與原核表達外源蛋白相比，酵母表達系統操作簡單、表達蛋白具有天然構象（糖基化、蛋白加工等），具有更高的生物活性、易于高密度發酵培養、蛋白表達量高、成本低、易純化等優點，在生產實踐中應用越來越廣泛。

本試驗將PoIFN-α6基因連接到pPICZαA載體，構建pPICZαA-PoIFNα6表達質粒并轉化畢赤酵母，獲得高效表達PoIFNα6的畢赤酵母；對畢赤酵母表達的PoIFNα6進行體外抗病毒活性研究。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、載體與菌株

牛腎細胞（MDBK）、猴腎細胞（Marc-145）、非洲綠猴腎細胞（Vero）、豬腎細胞（PK-15）、水皰性口炎病毒（VSV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬圓環二型病毒（PCV2）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、表達載體pPICZaA均由四川華神獸用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重點實驗室保存；E.coli DH5α感受態細胞、克隆載體pMD19-T購自TaKaRa。

1.2 主要試劑

DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量試劑盒購自AXYGEN；DNA Marker、T4連接酶、小鼠抗His單克隆抗體、HRP標記的兔抗小鼠IgG、DNA Marker、Protein Marker、蛋白胨、酵母氮源培養基、葡萄糖、YNB、W-TMB顯色試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Xho I、XbaI和SacI限制性內切酶購自NEB（北京）；ZecionTM購自Thermo Fisher scientific。

1.3 PoIFN-α6表達載體的構建

參照GeneBank中的IFNα6（GenBank：GQ415060），5和3端分別加Xho I和Xba I酶切位點，酵母密碼子偏嗜性由南京金斯瑞生物科技有限公司優化合成后將其克隆至pPICZaA載體中，將獲得載體命名為pPICZαA-PoIFNα6。

1.4 PoIFNα6的表達與鑒定

將重組載體pPICZαA-PoIFNα6經SacI限制性內切酶線性化后轉化至X33感受態細胞中，經含ZecionTM（200 μg/mL）抗性YPD平板篩選陽性菌落并挑取單菌落進行誘導表達，誘導72 h后收集細胞上清進行12% SDS-PAGE檢測，以誘導轉化空質粒的X33細胞上清為陰性對照。

SDS-PAGE結束后，利用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，PBST洗膜4次，每次5 min；將PVDF膜與小鼠抗HIS單克隆抗體（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，PBST洗膜4次，每次5 min；加入HRP標記兔抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min；進行W-TMB顯色。

1.5 PoIFNα6活性測定

參照細胞病變抑制法[17]并根據不同細胞系/對應病毒（PRRSV/Marc-145、PEDV/Vero、PRV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15、TGEV/PK-15、VSV/MDBK）進行體外活性檢測。細胞上清按10倍稀釋，連續稀釋7個梯度，每個梯度可設4個重復。中和的病毒含量為300～500 TCID50，同時設置陽性對照組和陰性對照組。當陽性對照組出現90%以上細胞病變時結晶紫染色，用酶標儀讀取570 nm波長數值，根據Reed-Muench法計算細胞上清的抗病毒活性效價。

2 結果與分析

2.1 重組載體pPICZαA-PoIFN-α6的鑒定

將優化后的PoIFN-α與pPICZαA經雙酶切后連接轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，ZecionTM（25 μg/mL）篩選平板篩選陽性轉化子并進行PoIFN-α6菌落PCR鑒定（目標條帶為1 035 bp）。經1%凝膠電泳分析，與預期一樣。測序結果與GenBank中登錄基因序列一致，表明重組質粒構建成功（圖1）。

2.2 PoIFNα6的表達與鑒定

將載體轉化畢赤酵母X33后，使用ZecionTM篩選平板挑取單個菌落，經1%甲醇誘導72 h后，離心取菌體上清經SDS-PAGE分析，在20～25 kDa處有特異目的蛋白條帶（圖2），大小與預期相符；而且Western blot檢測表明該蛋白能通過his標簽檢測（圖3），表明PoIFNα蛋白在細胞上清成功表達。

2.3 PoIFNα6活性研究

分別在PRRSV/Marc-145、PEDV/Vero、PRV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK15、TGEV/PK-15、VSV/MDBK系統上進行抗病毒活性檢測，結果如表1所。由表1可知，干擾素在多種來源的動物細胞中均表現出良好的抗病毒活性，在不同來源細胞中的抗病毒活性有差異，但其比活力均大于106 U/mg。

3 討論

當今豬病形式復雜，病毒性疾病占主導地位[18]，特別是近幾年暴發的豬流行性腹瀉、豬偽狂犬病給養殖行業帶來了直接的經濟損失。干擾素生物制劑由于其自身優勢成為了研究熱點。1986年，Lefevre[19，20]等首次利用大腸桿菌表達PoIFN-α。近年來，我國學者也相繼開展了PoIFN-α的研究，實現了PoIFN-α原核表達。由于大腸桿菌表達的PoIFN-α多以包涵體形式存在，表達產物需要經過變性、復性等工藝處理后才有生物活性，但處理后的PoIFN-α活性損失較大、工藝復雜導致實際生產應用中難以實現[21-23]。與原核表達外源蛋白相比，酵母表達外源蛋白具有天然構象不需要經過變形、復性等處理就具有較好的生物活性；在生產實踐中酵母具有高密度發酵培養、外源蛋白表達量高、成本低等優點，有良好的應用前景。

本試驗成功獲得穩定表達PoIFN-α6的畢赤酵母，并使用多種體外系統進行了活性測定。其中VSV/MDBK系統是豬干擾素抗病毒活性檢測系統中使用最廣泛的活性測定方法，在該系統中本研究所表達的重組豬干擾素活性（2.79×107 U/mg）比國內報道如：姚清俠[24]（8.0×106 U/mg）、葛麗[25]（4.0×104 U/mg）等略高。此外在多個系統中進行細胞病變抑制試驗后發現，豬重組干擾素α6在猴源細胞Marc-145、Vero和豬源細胞PK-15以及牛源細胞MDBK中均表現出良好的抗病毒活性，且對不同種類病毒也具有較高的抗病毒活性。本試驗結果表明豬重組干擾素α6具有廣譜抗病毒活性，這種廣譜性表現為對多種宿主的多種病毒的廣譜抗病毒活性，沒有種屬特異性。

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