酶法輔助優化平和蜜柚皮總黃酮的提取工藝研究*

謝勇武，譚屬瓊，張鷺文

（福建師范大學閩南科技學院，福建 泉州 362332）

蜜柚為蕓香科柑橘屬喬木，原產于中國福建，富含蛋白質、維生素等營養物質。平和蜜柚是琯溪蜜柚的一種，2007年被認定為中國馳名商標，2008年被認定為中國名牌農產品并被歐盟列為地理標志保護品種。黃酮類物質廣泛存在于自然界的植物中，屬植物次生代謝產物，許多水果皮中都含有豐富的黃酮類物質[1]。黃酮類物質產生的自由基存在于細胞膜的附近，是自由基猝滅劑和抗氧化劑[2-3]，可以起到抗癌、抗炎鎮痛和防輻射的作用[4-6]。黃酮類化合物來自于天然植物，可用于食品中防止食品酸敗氧化，延長食品保鮮期[7-9]，而生活中柚子皮除少量用來凈化空氣外大多數都當垃圾丟掉[10-11]。

本研究采用福建平和蜜柚皮為原料提取蜜柚皮總黃酮，研究提取的最佳工藝，提高產品附加值，為蜜柚皮加工提供參考依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

以福建平和縣產蜜柚為原材料，選成熟度好、新鮮的柚子，取皮洗凈晾干待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜜柚皮黃酮提取過程

平和蜜柚皮→切成碎片→80 ℃恒溫干燥→粉碎

→過60目標準樣篩→一定料液比加溶劑浸提→添加纖維素酶解→離心→比色計算提取率

1.2.2 繪制蘆丁標準曲線

參照車京梅等[12]的方法進行標準曲線的繪制：精確稱量在105 ℃鼓風干燥箱中烘干的蘆丁標準品10 mg，置于潔凈的燒杯中，加入體積分數為60%的乙醇使其充分溶解，然后全部轉移到50 mL比色管中，定容至刻度，搖勻，即得到濃度為0.200 mg/mL的蘆丁標準溶液。

分別移取上述蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于7支已編號的25 mL比色管中，分別加入濃度為5%的NaNO2溶液0.5 mL，搖勻經過6 min后，加入濃度為10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，再經過6 min后，加入濃度為4%的NaOH溶液5.0 mL，最后用濃度為60%的乙醇溶液定容至比色管的刻度線，搖晃至均勻，再靜置15 min。以0號管作空白對照組，在510 nm波長處測吸光值，測3組數據后取平均值。以吸光度Y為縱坐標，濃度X為橫坐標作圖，得出蘆丁濃度對吸光度的回歸方程為：y=9.745x-0.0033，R2=0.9999，標準曲線如下圖1所示：

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.3 柚子皮中黃酮的提取率的計算

取1.0 mL提取液放置在25 mL的比色管中，加入0.5 mL的NaNO2溶液（濃度5%，質量分數），搖勻經過6 min后，加入0.5 mL的Al(NO3)3溶液（濃度10%，質量分數），再經過6 min后，加入5.0 mL的NaOH溶液（濃度4%，質量分數），最后用60%（體積分數）的乙醇溶液定容，搖晃至均勻，靜置15 min測量吸光度。然后根據1.2.2中標準曲線方程計算提取液中蜜柚皮黃酮濃度，并按照如下公式計算蜜柚皮黃酮的提取率：

其中：C為黃酮的濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；W為稱取樣品蜜柚皮粉的質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同纖維素酶用量對蜜柚皮中的黃酮總量提取率的影響

準確稱取5份質量為1.000 g粉碎篩選后的蜜柚皮粉末，分別加入5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%的纖維素酶，加入蒸餾水進行調節使料液比為1∶20(g/mL)，接著放入溫度為50 ℃的水浴鍋處理1 h，在高速離心機（3000 r/min）離心15 min后準確量取1.0 mL上清液按照1.2.3的描述測定其提取率。結果如圖2。

圖2 纖維素酶用量對柚子皮中黃酮總量提取率的影響

圖2曲線可以看出黃酮提取率先隨纖維素酶用量提高而上升，之后再逐漸降低。在纖維素酶濃度為6.0%的時，黃酮提取率達到最高，為0.1722%。纖維素酶濃度在5.5%～6.0%的區間黃酮提取率是上升的，提取率在此區間提取率變化較大；纖維素酶用量在7.0%～7.5%這段區間表現為平滑的一段曲線，提取率變化不大；纖維素酶用量在6.0%～7.0%時黃酮提取率是下降的，變化較明顯。所以，通過曲線可以得出纖維素酶濃度6%左右時達到了蜜柚皮黃酮總量提取率的最大值。

2.1.2 料液比對柚子皮中黃酮總量提取率的影響

準確稱取5份質量為1.000g粉碎篩選過后的蜜柚皮粉末，加蒸餾水使料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)，之后加入6%的纖維素酶，放入溫度為50 ℃的水浴鍋，50 ℃加熱處理1 h之后在高速離心機（3000 r/min）離心15 min后準確量取上清液1.0 mL按1.2.3的描述測定其提取率。結果如圖3。

圖3 不同料液比對柚子皮中的黃酮總量提取率的影響

由圖3可知，料液比在1∶20至1∶25的時候該曲線呈上升趨勢，即蜜柚皮中的總黃酮提取率是逐漸升高，料液比為1:25左右總黃酮提取率達到最高值，原因可能是由于料液比的增加使料液與蜜柚皮充分反應進而升到最高；在料液比為1:25之后提取率是下降的，這可能是由于大量的雜質進入，稀釋后導致提取率降低；在該曲線的1∶30至1∶40之間下降的較為平滑，可能是因為大容量的溶劑使溶質稀釋導致無法發生反應從而浪費多余的料液，同時還相應地增加了實驗誤差。綜上所述，料液比選定最佳參數為1∶25。

2.1.3 不同酶解溫度比對柚子皮中黃酮總量提取率的影響

準確稱取5份質量為1.000g粉碎篩選后的蜜柚皮粉末，加入6%的纖維素酶后加蒸餾水使料液比為1∶25，分別在溫度40、45、50、55、60 ℃的水浴鍋加熱處理1 h，在高速離心機（3000 r/min）離心15 min后準確量取上清液1.0 mL，按1.2.3的描述測定其提取率。結果如圖4。

圖4 溫度比對柚子皮中的黃酮量提取率的影響

由圖4可以看出提取率隨溫度升高而提高，在55 ℃左右達到最高值，之后開始降低。曲線說明溫度在55 ℃以下時溫度提升促進酶與蜜柚皮的反應，溫度為55 ℃的時候達到了反應的峰值；當溫度從55 ℃升至60 ℃時，提取率反而降低則可能是溫度過高使酶的分子結構被破壞而失活，導致提取率的逐漸下降。綜上所述，酶解溫度選定最佳參數為55 ℃。

2.1.4 不同時間比對柚子皮中黃酮總量提取率的影響

準確稱取5份質量為1.000g粉碎篩選過的蜜柚皮粉末，加入6%的纖維素酶后加蒸餾水調整料液比為1∶25，在溫度為55 ℃的水浴鍋中分別處理30、60、90、120、150 min之后，在高速離心機（3000 r/min）離心15 min后準確量取上清液1.0mL，按1.2.3的描述測定其提取率。結果如圖5。

圖5 時間比對蜜柚皮中的黃酮量提取率的影響

表1 正交試驗單因素水平表

由圖5可知酶解時間在30 min到120 min總黃酮提取率隨時間增加逐漸上升，120 min時提取率達到最高值，為0.4934%。從曲線可以看出，隨著酶與蜜柚皮粉末酶解反應的進行總黃酮提取率逐漸升高，120 min之后總黃酮提取率降低可能是由于物料流失或者酶解時間過長、酶活性減弱等因素造成，需進一步研究。

綜上所述，酶解時間選定最佳參數為120 min。

2.2 蜜柚皮總黃酮提取率的正交實驗結果

通過對影響蜜柚皮提取率的4個變量（酶用量、料液比、酶解時間、酶解溫度）的單因素試驗結果的綜合分析，設計L9(34)的正交實驗。各單因素水平見表1，正交實驗結果見表2。

據表2可知正交試驗中總黃酮提取率最高的為6號工藝參數組合，但最優工藝參數組合是D2B3C3A3，而所列的正交表中并沒有該組，故進行該組變量的驗證實驗。實驗后測得該組工藝參數組合的黃酮提取率為0.514%，低于正交試驗中的6號工藝參數組合得出的黃酮提取率。所以通過驗證實驗和正交實驗得出的最優工藝參數組合為D2B3C1A2，即：6%酶用量、1∶30料液比、90 min酶解時間、50 ℃的酶解溫度，得出最高黃酮提取率為0.546%。

各因素對平和蜜柚皮總黃酮提取率影響的主次順序為：酶解溫度＞料液比＞酶解時間＞酶用量。原因是處理的時間影響柚子皮黃酮提取，而長時間的酶解不會對黃酮提取有太大的幫助；溫度對酶解效率會產生影響，酶解過程存在最適宜的溫度，超過此溫度會導致酶結構的破壞從而降低提取率，從正交試驗結果分析看出酶解溫度為影響最大的因素。

表2 正交試驗結果與分析

3 結論

本研究將福建平和蜜柚皮為原料切片烘干粉碎過篩后用植物纖維素酶進行總黃酮提取，對提取工藝參數酶濃度、酶解時間、酶解溫度、料液比進行單因素分析，得出正交實驗各單因素水平值，并在單因素實驗基礎上進行正交實驗和驗證，最終得到的福建平和蜜柚皮總黃酮的最佳提取工藝條件為：纖維素酶6%，料液比1∶30，酶解溫度50 ℃， 酶解時間90 min，得到的總黃酮提取率為0.546%。本研究可以為今后蜜柚皮的加工處理提供新的參考，從而提高產品附加值。