殼聚糖對冷藏鯉魚片品質變化的影響

孫小惠，薛 衡，洪 惠，李 燕，羅永康*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

鯉魚（Cyprinus carpio）原產亞洲，是淡水魚類中分布最廣、養殖歷史最悠久的溫帶淡水經濟魚類[1]。鯉魚肉質細嫩、營養豐富、蛋白質含量高，脂肪多以不飽和脂肪酸為主，易被人體消化吸收[2]，并且能給人體提供必需的氨基酸、維生素等營養成分[3]。但魚肉由于水分含量高、組織細嫩、蛋白水解酶活性較強，易發生腐敗變質[4]。因此，探究水產品有效的貯藏保鮮方法對降低損失、提高經濟效益、促進水產品行業的生產發展至關重要[5]。

目前，水產品的貯藏保鮮方法主要有氣調保鮮、低溫保鮮及化學保鮮等[6]。近年來，各類天然保鮮劑逐漸成為水產保鮮行業的研究熱點。殼聚糖是α-氨基-D-葡胺糖通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的直鏈狀多糖，可以通過甲殼素脫乙酰制得[7]，具有抗菌性、成膜性及無毒無害等多種優良特性[8]。殼聚糖容易在物體表面形成對O2、CO2、C2H4具有一定選擇滲透作用的半透膜，可以有效減少微生物的污染[9]。由于殼聚糖具有多種優點，已經逐漸成為天然食品添加劑領域研究的熱點材料[10]。

Hassanzadeh等[11]研究含葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）的殼聚糖食用涂料對冷藏虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）片貨架期的影響，指出經2%殼聚糖涂膜的虹鱒魚塊的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、過氧化值（peroxide value，POV）和pH值均低于對照組魚片，并且加入0.1% GSE的殼聚糖涂膜具有更好的效果，在抑制需氧嗜溫和嗜冷細菌方面效果顯著，可以幫助維持感官質量并延長虹鱒魚片在冷藏條件下的貨架期。Gómez-Estaca等[12]研究殼聚糖與丁香精油結合對鱈魚（Pollachius pollachius）的保鮮效果，結果表明，殼聚糖與丁香精油結合處理能夠顯著抑制革蘭氏陰性桿菌的生長，特別是有效抑制腸桿菌的增長。Li Tingting等[13]研究茶多酚、迷迭香提取物與殼聚糖相結合對4 ℃冷藏大黃魚（Pseudosciaena crocea）的保鮮效果，結果表明，0.2%茶多酚和0.2%迷迭香浸漬處理后與殼聚糖包衣相結合可以有效保持魚片的品質，并且與對照組相比，保質期延長8～10 d。Mohan等[14]研究食用殼聚糖涂層（1%和2%）對冰凍印度油沙丁魚（Sardinella longiceps）品質的影響，結果表明，殼聚糖食用涂層可以有效抑制細菌生長，顯著減少揮發性堿和氧化產物的形成，并且提高魚肉的持水能力。

目前，殼聚糖對冷藏鯉魚片品質影響方面的研究較少，且殼聚糖不溶于水，能溶于稀酸，大多數研究均采用醋酸溶解殼聚糖形成的溶液來處理魚片。醋酸本身具有一定的防腐和抑菌效果，因此無法判斷在此過程中殼聚糖自身所發揮的效應。因此本研究以鯉魚為研究對象，通過測定4 ℃冷藏條件下對照組、20 g/L殼聚糖+0.5%醋酸組以及0.5%醋酸組鯉魚片的感官分值、菌落總數（total aerobic counts，TAC）、生物胺含量、揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量及pH值等指標，探討殼聚糖對鯉魚片品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 條鯉魚購于北京北醫三院農貿市場，平均體質量（0.98±0.03） kg，平均體長（37.00±1.00） cm；殼聚糖購于國藥集團化學試劑有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KDY-9820半自動凱式定氮儀 北京通潤源機電儀器設備公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；BCD-251WBCY冰箱 青島海爾股份有限公司；YT-C1-1ND超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發中心；FW2000高剪切分散乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；LC-10AT series高效液相色譜儀 日本島津公司；FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鯉魚預處理

鮮活鯉魚運到實驗室后，立即宰殺、去鱗、去頭、去內臟，清洗內部及體表，每條魚取兩側魚片，單條鯉魚耗時約5 min。使用自來水將魚片表面清洗干凈并瀝干，將魚片分為3 組。對照組置于聚乙烯保鮮袋中，于4 ℃冰箱中貯藏；T1組用20 g/L殼聚糖+體積分數0.5%醋酸水溶液浸泡1 min后置于聚乙烯保鮮袋中，于4 ℃冰箱中貯藏；T2組用體積分數0.5%醋酸水溶液浸泡1 min后置于聚乙烯保鮮袋中，于4 ℃冰箱中貯藏。每隔2 d每組隨機取3 塊魚片進行TAC、TVB-N含量、生物胺含量、感官分值和pH值的測定。

實驗前對不同體積分數醋酸溶解的殼聚糖溶液進行可接受性測試，最終選擇0.5%作為醋酸的最終體積分數。

1.3.2 感官分值測定

參照周忠云等[15]的方法。由經過培訓的8 名實驗室成員組成感官評價小組，根據表1所示的鯉魚感官評分標準進行打分。各項目指標分5 級，最高分為5 分，最低分為1 分，總分為20 分。將4 個項目的總分計為該魚塊的綜合得分，感官分值低于12 分認為無法食用。

1.3.3 TVB-N含量測定

參照Hong Hui等[16]的方法，并稍作修改。取5.00 g絞碎的魚肉，加入50 mL蒸餾水，均質25 s后置于搖床上振搖30 min，離心3 min（3 600 r/min）；取5 mL離心管中的上清液和5 mL氧化鎂懸濁液（10 g/L）于消化管中混合后進行蒸餾，向10 mL硼酸溶液（20 g/L）中加入50 μL甲基紅-次甲基藍指示劑（2 g/L）作為吸收液，蒸餾5 min；用鹽酸標準溶液（0.01 mol/L）進行滴定，根據消耗的鹽酸標準溶液體積計算TVB-N含量，滴定終點為藍紫色。

1.3.4 pH值測定

參照汪之穎等[17]的方法，使用pH計進行測定。

1.3.5 TAC測定

參照胡素梅等[18]的方法，并稍作修改。在超凈工作臺中稱取5.00 g魚肉，放入拍打袋內，向其中加入45 mL無菌生理鹽水，放入拍打式均質機拍打15 s，制成質量濃度為10 g/mL的樣品稀釋液；用4.5 mL的無菌生理鹽水進行梯度稀釋。選擇2～3 個合適的稀釋度，用平板涂布法進行測定。培養條件：（30±1） ℃，72 h。

1.3.6 生物胺含量測定

參照Shi Ce等[19]的方法，并稍作修改。取5.00 g絞碎的魚肉，加入10 mL 0.6 mol/L、4 ℃的高氯酸溶液，勻漿20 s，4 ℃條件下離心（10 000×g，5 min）后，取上清液，所得沉淀重復上述步驟，合并2 次離心所得上清液，用0.6 mol/L高氯酸溶液將其定容至25 mL。提取液保存在-20 ℃條件下待測。

生物胺的衍生：取0.2 mL生物胺提取液，依次加入40 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、60 μL飽和碳酸氫鈉溶液和0.4 mL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，丙酮溶解），混合均勻后于40 ℃條件下避光反應45 min，殘余的丹磺酰氯用20 μL的濃氨水去除；室溫靜置30 min后，用乙腈調整體積至1 mL，最后用0.22 μm的有機相濾膜過濾。

液相色譜檢測條件：色譜柱為COSMOSIL 5C18-PAQ反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進樣量50 μL；流動相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈溶液；采用梯度洗脫方式，洗脫程序為：0 min，50%流動相B；25 min，90%流動相B；35 min，90%流動相B；45 min，50%流動相B；流動相流速0.8 mL/min；檢測波長254 nm。通過比較樣品和生物胺標品的保留時間和峰面積進行定性及定量分析。

1.4 數據處理

實驗數據均為3 個平行，采用Excel 2013進行數據處理，SPSS軟件進行單因素方差分析，各組數據之間的差異性用最小顯著性差異法在0.05的置信區間（P＜0.05）進行分析，實驗結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖對冷藏鯉魚片感官品質的影響

圖1 鯉魚片貯藏期間的感官分值變化Fig.1 Changes in sensory scores of carp fillets during storage

由圖1可知，3 組鯉魚片的感官分值均隨著貯藏時間的延長而下降。貯藏前4 d，3 組鯉魚片的感官分值均緩慢下降，且無顯著性差異（P＞0.05）；貯藏4 d后，隨著貯藏時間的延長，對照組鯉魚片的感官分值下降最快，在貯藏第6、8、10天時的感官分值分別下降至13.32、11.33、7.24 分，貯藏8 d時已經伴隨明顯的腐敗臭味，這與呂健等[20]對冷藏鳙魚片的研究結果相似。T1、T2組鯉魚片的感官分值變化趨勢較為相似，但T2組鯉魚片的感官分值在貯藏期間低于T1組，這主要是由于T2組鯉魚片有輕微的酸味，魚肉體表泛白且彈性較差。貯藏8 d時T1、T2組鯉魚片的感官分值分別降至15.10和14.36，并在10 d后不可接受。與對照組相比，T1組鯉魚片的感官可接受時間延長了約2 d，這可能是由于殼聚糖和醋酸抑制了微生物的繁殖，從而延緩了鯉魚片感官品質的劣變。

2.2 殼聚糖對冷藏鯉魚片TVB-N含量的影響

圖2 鯉魚片貯藏期間的TVB-N含量變化Fig.2 Changes in TVB-N content of carp fillets during storage

TVB-N是評價魚肉腐敗變質的常用指標，TVB-N含量越大說明肉類的腐敗程度越高[21]。由圖2可知，鯉魚片的初始TVB-N含量為5.32 mg/100 g。貯藏前6 d，各組鯉魚片的TVB-N含量平穩上升，無顯著差異（P＞0.05），這是由于貯藏初期的TVB-N主要來源于腺嘌呤核苷酸在內源酶作用下發生的脫氨反應，此時魚肉中的微生物正處于被抑制生長的狀態，直至后期微生物進入對數生長期，代謝作用旺盛，才使TVB-N含量快速增加[22]。隨著貯藏時間的延長，對照組鯉魚片第8天時的TVB-N含量顯著升高（P＜0.05），在貯藏10 d時達到最大值31.37 mg/100 g，超過淡水魚TVB-N含量的二級鮮度標準（20 mg/100 g），與T1、T2組差異顯著（P＜0.05），這與Zhang Yuemei等[23]對鯉魚片的研究結果相類似。T1組鯉魚片的TVB-N含量在貯藏10 d時出現較為明顯的上升，達13.07 mg/100 g（＜20 mg/100 g）。T2組鯉魚片的TVB-N含量變化趨勢與T1組類似，在貯藏10 d時達15.96 mg/100 g。整個貯藏過程中，T1、T2組鯉魚片的TVB-N含量均未超過二級鮮度標準，并且T1組低于T2組。殼聚糖作為一種抗菌劑，能夠抑制部分微生物的生長繁殖，對微生物分解魚肉蛋白質具有一定的抑制作用，同時可以抑制酶的活性，由此可以看出殼聚糖具有延緩腐敗的作用。

2.3 殼聚糖對冷藏鯉魚片pH值的影響

圖3 鯉魚片貯藏期間的pH值變化Fig.3 Changes in pH value of carp fillets during storage

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，3 組鯉魚片的pH值均先下降后上升。生鮮鯉魚片的pH值為6.84，對照組鯉魚片在貯藏第2天下降到最低值（6.47），T1、T2組在第4天下降至最低值，分別為6.48和6.59。貯藏初期，糖原酵解產生乳酸，ATP、磷酸肌酸等物質分解產生磷酸等酸性化合物，使得魚肉的pH值逐漸降低，但隨著貯藏時間的延長，魚肉進入自溶腐敗階段，其中的蛋白質在微生物的作用下發生分解，產生堿性物質，使魚肉的pH值逐漸升高[24]。貯藏第10天，對照組鯉魚片的pH值升高至7.02，而T1組為6.72，顯著低于對照組（P＜0.05），并且低于T2組。醋酸的加入使魚片的pH值保持在較低的水平，同時，殼聚糖的加入能夠抑制鯉魚片中微生物的生長繁殖，延緩pH值的變化，改善魚肉品質。

2.4 殼聚糖對冷藏鯉魚片TAC的影響

魚肉中的各類微生物是引起魚肉腐敗變質的重要原因[25]。由圖4可知，對照組鯉魚片的初始菌落總數為3.49 （lg（CFU/g）），而T1、T2組鯉魚片的初始菌落總數分別為2.71、3.10 （lg（CFU/g）），這可能是由于醋酸及殼聚糖處理具有殺滅微生物的作用。3 組鯉魚片的TAC均隨著貯藏時間的延長顯著升高（P＜0.05）。貯藏前4 d，對照組鯉魚片的微生物生長速率顯著高于T1、T2組（P＜0.05），并在貯藏6 d時達到7.46 （lg（CFU/g）），超過微生物可接受標準（7.00 （lg（CFU/g）））[26]，這與王航等[27]的研究結果相似。T1組鯉魚片的TAC顯著低于對照組與T2組（P＜0.05），并在貯藏8 d時達到7.31 （lg（CFU/g）），表明殼聚糖具有一定的抑菌作用。T2組鯉魚片的TAC在貯藏前4 d顯著低于對照組（P＜0.05），但在4 d后迅速上升，并在6 d時達到7.41 （lg（CFU/g）），可以看出醋酸本身具有一定的抑菌效果，但殼聚糖結合醋酸的抑菌效果最好。

圖4 鯉魚片貯藏期間的TAC變化Fig.4 Changes in TAC of carp fillets during storage

2.5 殼聚糖對冷藏鯉魚片生物胺含量的影響

表2 鯉魚片貯藏期間的生物胺含量變化Table 2 Biogenic amine concentrations in carp fillets during storage mg/kg

由表2可知，所有樣品中，精胺是主要生物胺，其在被檢測的5 種生物胺（腐胺、尸胺、組胺、亞精胺和精胺）中含量最高，這與張月美等[28]的研究結果相似。腐胺、尸胺和組胺的含量通常用于確定魚肉的品質和安全性，Marks等[29]的研究也指出，腐胺和尸胺可以更好地反映魚體的腐敗程度。

鯉魚片中組胺含量為0.46～2.20 mg/kg，遠低于規定的組胺最大限量值50 mg/kg[30]。在貯藏過程中，3 組鯉魚片的組胺含量均呈先升高后降低的趨勢，這可能是由于隨著腐敗程度的增大，微生物的增加利用了部分組胺，3 組樣品的組胺含量未見顯著差異（P＞0.05）。貯藏初期，3 組鯉魚片中的腐胺和尸胺含量均較低，但隨著貯藏時間的延長，腐胺和尸胺的含量顯著上升（P＜0.05）。新鮮鯉魚片的腐胺含量為0.27 mg/kg，在貯藏8 d后達到1.01 mg/100 g，而T1、T2組分別達0.48、0.65 mg/kg，均顯著低于對照組（P＜0.05）。貯藏第10天，對照組鯉魚片的腐胺含量達5.91 mg/100 g，T2組達1.26 mg/100 g，而T1組僅為0.60 mg/100 g，顯著低于對照組和T2組（P＜0.05）。對照組鯉魚片貯藏10 d時的尸胺含量為0.86 mg/100 g，顯著高于T1、T2組（P＜0.05），并且在貯藏末期，T1組鯉魚片的尸胺含量顯著低于T2組（P＜0.05）。腐胺含量在貯藏后期迅速上升，這可能是由于貯藏后期魚肉中的微生物大量生長繁殖并產生氨基酸脫羧酶，氨基酸脫羧基而形成[31]。T1組鯉魚片貯藏后期的腐胺、尸胺含量顯著低于對照組和T2組，這可能是由于殼聚糖抑制了能夠產氨基酸脫羧酶微生物的生長。

3 結 論

在4 ℃冷藏條件下，鯉魚片的感官分值隨著貯藏時間的延長不斷下降，TVB-N含量、TAC、腐胺和尸胺的含量呈現明顯上升趨勢；使用20 g/L殼聚糖+體積分數0.5%醋酸處理鯉魚片后發現，其能抑制鯉魚片中微生物的生長，延緩TVB-N、腐胺和尸胺含量的上升以及pH值的變化，降低魚片的腐敗速率，延緩鯉魚片感官品質的下降。鯉魚片在4 ℃冷藏條件下的貨架期約為8 d，殼聚糖處理可將鯉魚片的貨架期延長2 d。