ATP13A2基因多態性與新疆地區帕金森病的相關性

周東瑞,楊新玲

(1新疆醫學科大學第二附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830063;2新疆醫學科大學第二附屬醫院神經內科;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種進行性神經退行性疾病,其病理特征在于黑質致密部的多巴胺能神經元的喪失以及在受影響的大腦區域中存在稱為路易體的蛋白質包涵體[1]。PD的發病與年齡、環境以及遺傳因素相關,到目前為止,已發現21種與家族性PD相關的致病基因[2],其中ATP13A2基因(也稱為PARK9)是目前帕金森遺傳發病機制的研究熱點之一,其突變與PD、Kufor-Rakeb綜合征、神經元蠟樣脂褐質沉積[3]和遺傳性痙攣性截癱[4]相關;目前研究認為ATP13A2基因是PD的易感致病基因,在早發性PD(early-onset Parkinson’s disease,EOPD),晚發性PD(late-onset Parkinson’s disease,LOPD),家族性PD(familial Parkinson’s disease, FOPD)均可發現ATP13A2的突變[5],其中Thr12Met(rs151117874)突變與早發性以及家族性PD相關,高頻單核苷酸多態性位點(single nucleotide polymorphism,SNP)C.1815C>T(rs2076603)也是目前研究熱點之一[6],而國內外目前尚缺乏相關研究報道;本研究選擇新疆地區維吾爾族、漢族PD患者以及健康者為研究對象,探討Thr12Met位點突變和C.1815C>T位點多態性與新疆地區維吾爾族和漢族人群帕金森病的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象共452例,其中包括PD患者222例和健康對照者230例,病例組為2017-12～2018-05就診于新疆醫科大學第一附屬醫院神經內科專病門診的PD患者,其診斷符合英國帕金森病協會腦庫臨床診斷標準,所有診斷均由兩位神經內科副主任以上醫師進行審核,排除繼發性帕金森病、帕金森疊加綜合征、其他神經系統疾病和伴有嚴重器質性疾病的患者,PD患者共222例,年齡(63.5±10.4)歲,年齡≤50歲為早發性帕金森病組(EOPD組),年齡>50歲為晚發性帕金森病組(LOPD組);其中EOPD組27例,LOPD組195例;維吾爾族84例,漢族138例;男114例,女108例;健康對照組為同期該地區年齡、性別、族別相匹配,且家族中無PD家族史的健康體檢者,健康對照者共230例,年齡(62.1±10.7)歲,其中維吾爾族97例,漢族133例;男117例,女113例。兩組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有患者對本研究均知情同意,本研究通過筆者醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 抽取患者外周靜脈血2 ml置于含800 μl乙二醇四乙酸的抗凝管中,使用天根生化(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,嚴格按照試劑盒配套說明操作書操作。檢驗DNA純度為1.7-1.9,濃度≥10 ng/μl,判為DNA純度合格。樣本-20 ℃保存,備用。

1.2.2 PCR擴增 引物設計由上海生工公司合成,Thr12Met位點引物序列上游5′-TGCCTCCCCAAATGACCTTTC-3′,引物序列下游5′-CTCACTGCGCTTCTCTAGCC-3′;C.1815C>T位點引物上游5′-ACCCACCATTCAGTCTCCCAT-3′,引物下游5′-ATTCTGTGCCAATGCCCAACC-3′。聚合酶鏈反應(PCR)體系共30 μl:10×PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,上下游引物各1.5 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,TaKaRa TaqTMPolymerase(5 U/μl)0.3 μl,DNA模板10-20 ng,去離子水補至30 μl,PCR反應條件:95 ℃預變性5 min后,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 S,72 ℃延伸60 s,35個循環后,72 ℃再充分延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 PCR擴增產物檢測及測序 將7 μl PCR產物加樣于2%瓊脂糖凝膠中,核酸染料染色,2000Marker作為標準對照,調整電壓120 V、電流100 A電泳,紫外儀上觀察并拍照。采用直接測序法檢測所有受試者的PCR產物目的片段的堿基序列,該過程由生工生物工程有限公司(上海)完成。

1.2.4 DNA測序法基因型分析 Thr12Met多態位點基因型分為野生GG基因型、雜合變異GA基因型、純合變異AA基因型;C.1815C>T多態位點基因型分為野生GG基因型、雜合變異AG基因型、純合變異AA基因型。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

病例組與對照組的基因型多態性分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05),吻合度良好。

2.2 ATP13A2基因Thr12Met位點PCR及基因測序結果

222例PD患者和230例健康對照者基因型均為野生GG基因型,未發現雜合變異GA基因型及純合變異AA基因型,ATP13A2基因Thr12Met位點經PCR擴增后產物片段的理論值為484 bp,在2%瓊脂糖凝膠上電泳可顯示該PCR的擴增產物(見圖1),測序結果經序列對比后病例組和對照組均未發現Thr12Met突變位點,均為GG型(見圖2)。

2.3 ATP13A2基因C.1815C>T位點PCR及基因測序結果

M. DNA標志物;1-9.PCR擴增產物電泳圖

圖2 Thr12Met位點基因測序結果Figure 2 Sequencing at Thr12Met site

病例組GG型88例、AG型96例、AA型38例;對照組GG型96例、AG型112例、AA型22例;ATP13A2基因C.1815C>T位點經PCR擴增后產物片段的理論值為492 bp,在2%瓊脂糖凝膠上電泳可顯示該PCR的擴增產物(見圖3),ATP13A2基因C.1815C>T位點直接測序結果見圖4,可見圖4A為野生GG基因型;圖4B為雜合變異AG基因型,可見從左向右堿基序列第13個本來是G,結果突變成了A,測序結果為雜合變異,雙峰圖;圖4C為純合變異AA基因型,單峰圖(見圖4)。

M. DNA標志物;1-9.PCR擴增產物電泳圖

2.4 病例組和對照組Thr12Met位點基因型與等位基因分布比較

病例組與對照組均未檢測出ATP13A2基因Thr12Met位點GA型和AA型,其變異頻率為0;兩組Thr12Met位點基因型與等位基因分布比較,差異均無統計學意義(P>0.05,見表1);病例組與對照組ATP13A2基因Thr12Met多態性在維吾爾族與漢族間、不同性別間、不同年齡段間分布差異均無統計學意義(P>0.05,見表1)。

2.5 病例組和對照組C.1815C>T位點基因型與等位基因分布比較

圖4 C.1815C>T位點不同基因型測序圖Figure 4 Gene sequencing at C.1815C>T site

表1 PD組與對照組Thr12Met位點基因型與等位基因頻率比較 例(%)Table 1 Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between case group and control group cases(%)

病例組和對照組C.1815C>T位點基因型與等位基因分布比較,差異無統計學意義(P>0.05,見表2);年齡≤50歲病例組和對照組、年齡>50歲病例組和對照組、年齡≤50歲病例組和年齡>50歲病例組C.1815C>T位點基因型與等位基因分布比較,差異均無統計學意義(P>0.05,見表3);男性病例組和對照組、女性病例組和對照組、男性病例組和女性病例組C.1815C>T位點基因型與等位基因分布比較,差異均無統計學意義(P>0.05,見表4);C.1815C>T位點基因型頻率與等位基因頻率在維吾爾族病例組和對照組、漢族病例組和對照組、維吾爾族病例組和漢族病例組間比較差異均無統計學意義(P>0.05,見表5)。

表2 PD組與對照組C.1815C>T位點基因型與等位基因頻率比較 例(%)Table 2 Comparison of C.1815C>T genotype and allele distribution between case group and control group cases(%)

表3 不同發病年齡PD組與對照組C.1815C>T位點基因型與等位基因頻率比較 例(%)Table 3 Comparison of C.1815C>T genotype and allele distribution between case group and control group in two different age ranges cases(%)

表4 不同性別PD組與對照組C.1815C>T位點基因型與等位基因頻率比較 例(%)Table 4 Comparison of C.1815C>T genotype and allele distribution in different genders between case group and control group cases(%)

表5 維吾爾族、漢族PD組與對照組C.1815C>T位點基因型與等位基因頻率比較 例(%)Table 5 Comparison of C.1815C>T genotype and allele distribution in Uygur and Han ethnic between case group and control group cases(%)

3 討論

ATP13A2基因編碼一種具有P型ATP酶家族特征的所有必需結構域的蛋白質,其蛋白位于溶酶體和晚期內涵體中,研究表明它涉及多種細胞功能,包括重金屬Mn2+、Zn2+穩態[7,8],線粒體穩態[9],以及溶酶體和內溶酶體蛋白穩態[10]。目前已發現多種ATP13A2基因突變位點及SNP,如雜合突變Thr12Met、Gly533Arg等,純合錯義突變Phe182Leu、Gly504Arg等,SNP C.1815C>T、IVS6+70A>G等,其中雜合突變(即Thr12Met和Gly533Arg)損害定位于微粒體的ATP13A2的ATP酶活性,純合錯義突變(即Phe182Leu和Gly504Arg)顯著損害ATP13A2蛋白質的穩定性,破壞ATP13A2的細胞質囊泡定位并促進其錯誤定位于內質網[11];因此 ATP13A2蛋白可能提供線索,用于了解常見的晚發型PD的發病機制,將疾病病因學中的遺傳和環境因素聯系起來[12]。

本研究運用聚合酶鏈反應(PCR)和基因測序相結合的方法,對新疆地區維吾爾族、漢族PD患者及健康對照組的ATP13A2基因多態性進行分析,結果提示ATP13A2基因Thr12Met位點突變頻率為0,未發現雜合變異GA基因型、純合變異AA基因型;提示ATP13A2基因Thr12Met突變在新疆地區維吾爾族、漢族PD患者中可能罕見。DiFonzo等[13]在一位年輕發病的意大利帕金森病患者首次發現Thr12Met雜合突變;Li等[14]對中國新疆地區420例PD患者和400例對照組進行研究,發現2例漢族EOPD患者Thr12Met位點雜合突變,與本研究結果不同;而Vilario-Güell等[15]檢測了突尼斯13個家系240例散發PD患者和372例正常對照者,未發現Thr12Met突變;Djarmati等[16]分析了德國、塞爾維亞、加拿大、波斯和挪威共112例早發型PD患者和55例正常對照者,也沒有發現Thr12Met突變,與本次研究結果一致。雖然新疆地區維吾爾族具有與漢族不同的遺傳背景,但是研究結果表明新疆地區維吾爾族、漢族PD患者Thr12Met位點基因型及等位基因分布間無明顯差異,不同性別病例組與相應對照組基因型和等位基因頻率分布比較差異不明顯,EOPD組與年齡≤50歲對照組及LOPD組與年齡>50歲對照組間差異也不明顯,提示ATP13A2基因Thr12Met多態位點在維吾爾族、漢族兩民族PD患者間可能存在較小差異,而且可能與性別及年齡關系也不顯著。

ATP13A2基因C.1815C>T位點雜合變異AG基因型頻率在病例組和對照組分別為43.2%和48.7%,純合變異AA基因型頻率分別為17.1%和9.6%,Kruer等[6]對76例肌張力障礙帕金森病患者和92例NBIA患者的基因測序研究提示:C.1815C>T多態性存在于≥20%病例中,與此次研究結果一致。本研究結果顯示ATP13A2基因C.1815C>T多態性在病例組與對照組、EOPD組與年齡≤50歲對照組、LOPD組與年齡>50歲對照組、男性病例組及女性病例組與相應性別對照組、維吾爾族病例組及漢族病例組與相應民族的對照組基因型和等位基因頻率分布比較,差異均無統計學意義,提示C.1815C>T多態性與PD患者的年齡、性別、民族可能無相關性,與Vilario-Güell等[15]對北非突尼斯89例家族性帕金森病患者ATP13A2基因序列分析研究結論一致,提示該基因位點多態可能與新疆地區散發性PD沒有明顯相關性,故該疾病仍需進一步基因檢測研究。

綜上所述,本研究未發現ATP13A2基因Thr12Met位點突變以及C.1815C>T多態性與新疆地區維吾爾族、漢族人群PD的發生存在相關性,該研究與國內外報道既有一致也有不同,原因可能是樣本量不足或存在地域差異;故仍需繼續不同區域、擴大樣本量進一步研究ATP13A2基因多態性與PD族別、性別、年齡的關系,以找出真正與PD發病相關的易感基因突變位點,為PD發病機制提供新的見解并確定潛在的治療靶點。