沒食子和五倍子體外抑菌作用比較研究

張小莉，李 雪，高蘇妮，李康社

（陜西省咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712000）

沒食子來源于殼科植物沒食子樹Quercus infectoriaOliveier幼枝上由沒食子蜂Cynipsallae-tinctoriae-Olivier寄生所產生的蟲癭，分布于地中海沿岸、阿拉伯、土耳其、希臘及印度等地，主要成分為沒食子酸、檸檬酸及齊墩果酸[1]。五倍子為漆樹科植物鹽膚木RhuschinensisMill．青麩楊RhuspotaniniiMaxim．或紅麩楊Rhuspunjabensis Stew.var.sinica(Diels）Rehd．et Wils．葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis(Bell）Baker寄生而形成[2]，最早記載于《開寶本草》[3]，具有斂肺降火、斂汗、止血等功效，含有單寧、沒食子酸、五倍子油等成分，分布于四川、貴州、云南、陜西、廣西等地。因二者均有含量很高的沒食子酸和沒食子酸糅質，故均有較強的抑菌作用。本研究中參考2015年版《中國藥典(四部）》[4]通則1121中抑菌效力檢查法選擇菌株試驗，先用試管法找出最小抑菌濃度，選二者同濃度藥液，加同等菌落數量，比較抑菌作用。現報道如下。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑、菌株

藥材：五倍子飲片（產地陜西）由陜西鐸耀中藥飲片有限公司提供，沒食子藥材（原產地土耳其）由亳州市荷塘藥業有限公司提供、廣西口岸進口；破碎，備用。上述2種樣品均經本中心李雪副主任藥師鑒定為正品。

培養基與試劑：胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號為170615），胰酪大豆胨液體培養基(TSB，批號為 160803），沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號為150801），麥康凱瓊脂培養基（批號為151013），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（XLD，批號為160113），甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號為161008），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號為160121），均由北京陸橋技術股份有限公司提供，適用性檢查均符合2015年版《中國藥典(四部）》通則11055和1106要求，滿足本實驗要求。pH7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號為170314，北京陸橋技術股份有限公司）用于稀釋菌液。

菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B）26 003]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B）10 104]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B）63 501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F）98 001]，大 腸 埃 希 菌 （Escherichia coli）[CMCC(B）44 102]，沙門菌（Salmonella paratyphiB）[CMCC(B）50 0094]，均由中國食品藥品檢定研究院提供，所用菌株均為第3代。

1.2 儀器

AD-1000型電子天平（福州志華科學儀器電子有限公司）；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；BSP-250型生化培養箱，BMJ-250C型霉菌培養箱（上海迅博實業有限公司醫療設備廠）；LDZM-60-KCSⅡ型立式蒸汽壓力滅菌器（上海申安醫療器械廠）；100 ～1 000 μL 加液槍（分度值 100 μL，賽默飛世爾科技有限公司）；游標卡尺（規格為0～125 mm，分度值為0．02 mm，已校準，青海量具刃具有限責任公司）；無菌空白藥敏紙片（規格為直徑6mm，厚度1 mm，容積量20 μL，杭州微生物試劑有限公司，121℃滅菌30 min，備用）。

2 方法與結果

2.1 提取液制備

取五倍子200g，用800mL水浸泡1h后，煎煮30min，再分別加300 mL水煎煮2次，每次30 min，合并藥液，濃縮至1 000 mL，即得。沒食子藥材破碎后同法制得。

2.2 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門菌，34℃培養20 h新鮮胰酪大豆胨液體培養基（TSB）培養物，白色念珠菌25℃培養2 d新鮮SDB培養物，分別用pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋（至約10-7～10-5點計所加菌落數）。

2.3 體外抑菌試驗

2．3．1 試管法

將晾干的含有1 000 cfu菌液的上述藥敏紙片，置5 種不同質量濃度（0．2，0．1，0．05，0．025，0．012 5 g/mL）的藥液中浸泡1 h，分別置10 mL TSB 35℃培養48 h，觀察TSB是否渾濁，同時接種于各菌株分離瓊脂平板（除枯草芽孢桿菌接種于TSA平板外），即金黃色葡萄球菌接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板、銅綠假單胞菌接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板、大腸埃希菌接種于麥康凱瓊脂培養基平板、沙門菌接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板，于35℃培養24 h，白色念珠菌接種于念珠菌顯色培養基平板，35℃培養48 h，觀察是否有菌落生長。

陽性對照：取含有1 000 cfu菌液的藥敏紙片，置10 mL TSB中同上述條件培養，同時接種分別接種于菌株的分離性瓊脂培養基平板，便于確定陽性對照菌落本身存活和藥液中的菌與陽性對照是否一致。

陰性對照：取含有藥液的藥敏紙片，置10 mL TSB 35℃培養24 h，接種于TSA平板35℃培養24 h，觀察藥液本身情況。

結果：見表1。

2．3．2 紙片擴散法

將上述6種菌株液稀釋至105cfu/mL，分別取100μL(即1 000 cfu），用涂布棒均勻涂于胰酪大豆瓊脂平板（直徑90 mm），將含有上述2種藥液的藥敏紙片置含有上述菌液的TSA平板上，于35℃培養24 h（白色念珠菌培養48 h），觀察是否有圈和用游標卡尺測量圈直徑，比較圈的大小。結果見表2。

表1 試管法測定結果(g/mL）

表2 紙片擴散法測定結果（mm）

3 討論

由本研究結果可知，沒食子酸的抑菌效果較五倍子明顯。相同制備方法（水煎煮提取）相同濃度的藥液，同等數量的（103cfu）菌落數時，沒食子抑菌圈直徑均大于五倍子；從直徑上比較，金黃色葡萄球菌>銅綠假單胞菌>白色念珠菌>枯草芽孢桿菌>大腸埃希菌>沙門菌，對沙門菌幾乎無作用。

五倍子體外抑菌作用弱于沒食子，但五倍子國內產量大、品質好。沒食子屬外來藥材，在抑菌作用方面應用時，可考慮五倍子替代沒食子。此外，因前4種菌株在外界環境存在且易感染人體，而大腸菌和沙門菌主要是腸道致病菌，抑菌結果說明水提取液體外抑菌效果較好，符合預期試驗效果，與多項研究報道結果一致[5-7]，且發現對念珠菌起作用的主要成分是沒食子酸乙酯[7]。同時，劉現兵等[8]報道，五倍子（1 g/mL）體外對大腸埃希菌作用明顯。呂雪梅等[9]報道，桔梗五倍子提取液（0．1 g/mL）對大腸埃希菌無明顯抑制作用結果一致。

因沒食子和五倍子主要成分均是沒食子酸，水提取液pH均為4．0左右。一方面，沒食子酸本身呈酸性，而一般細菌生存環境 pH為6．5～7．2[10]，尤其金黃色葡萄球菌適宜pH偏堿性環境中存活[11]；另一方面，沒食子酸糅酸成分多于五倍子，起主要作用的沒食子酸鞣酸可使微生物體內的原生質凝固[12]，并通過抑制細菌代謝所需的酶類而發揮抑菌作用。

參照文獻[13]，中藥有效成分提取采用傳統方法-煎煮法。傳統抑菌試驗試管法依據GB15979-2002《一次性使用衛生用品標準》[14]，取樣片，加5 mL PBS緩沖液和100 μL菌液進行試驗，觀察抑菌情況。因為TSB是高富營養培養基，而PBS僅能維持微生物狀態，試驗時無法判斷抑菌是菌本身已經死亡還是樣片抑制導致。本試驗菌株和藥液作用一定時間，再置10 mL TSB中進行培養，觀察菌落生長情況，更能真實反映實際情況。

一定量的菌液與不同濃度的水提取液作用1 h，紙片置10 mL TSB中，參照2015年版《中國藥典(四部）》通則1106條件培養，接種至各自分離瓊脂培養基平板，從而利于初步判斷各管區別于其他管的菌落。通過試驗找出各個菌株的最小提取液濃度，也可以參照文獻[15]推算出最小抑菌濃度。

隨著提取液濃度和pH的改變，沒食子酸和沒食子鞣質抑菌活性的改變，二者抑菌強弱、抑菌菌株和順序可能發生變化的情況有待進一步研究。同時，大腸埃希菌一般在人體內體現其致病性，藥液進入體內是否有作用或同于體外效果，也有待進一步研究。