超聲波加工對蛋清蛋白質結構和凝膠特性的影響

葉 鈺，高金燕，陳紅兵，佟 平*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047； 2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047；3.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047）

蛋清凝膠作為一種食品原料，在生產加工中具有重要的作用，不僅可以改善食品的質地和形態，還可以提高食品的保水性、增稠性、黏結性等[1]。但由于蛋清的水分含量較高，乳化性相對較低，蛋清蛋白極容易發生變性，在保藏和運輸中蛋清的品質和功能特性會發生變化[2-3]。

為提高蛋清凝膠的穩定性和凝膠特性，胡瑞等[4]研究發現雜糧的種類與添加量可以影響雞蛋凝膠的保水性及質構特性，其中雜糧粉添加量與雞蛋凝膠的保水性、硬度、咀嚼性呈正相關，與彈性呈負相關性，結果顯示添加適量雜糧粉可以改善雞蛋凝膠的品質。曾虹艷等[5]研究不同磷酸鹽對雞蛋凝膠持水性的影響，結果表明，添加適量磷酸鹽可提高雞蛋凝膠的持水性。Handa等[6]研究不同pH值對熱誘導條件下蛋清凝膠質構特性的影響，發現在堿性條件下，溶液的pH值越高，蛋清凝膠的質構特性越好，網絡結構越有序。Croguennec等[7]研究發現金屬離子的種類與pH值對蛋清的凝膠性能有顯著影響。這些實驗所用到的方法在一定程度上可以提高蛋清凝膠的保水性，增加凝膠強度，但也破壞了蛋清蛋白的結構，產生的副產物會影響其營養價值，且存在一定的安全性問題。因此，在不破壞蛋清蛋白的情況下研究一種改善蛋清凝膠性質的技術對于凝膠產品的合理加工及開發具有實際的指導意義。

近年來，超聲作為一種改善蛋白質功能性質的綠色技術，在食品的破損檢測、乳化、均質、肉質嫩化、滅菌、提取、過濾、干燥等方面發揮著重要作用[8-10]。并且經研究發現，經過超聲處理后的蛋白質凝膠特性顯著增強[11-16]。Hu Hao等[11-12]發現大豆分離蛋白鈣離子熱凝膠和葡萄糖酸內酯熱凝膠經過高場強超聲處理后凝膠強度和保水性都增強，并且超聲處理后大豆蛋白的凝膠空間網絡變得更加致密、均一。Madadlou等[13]研究發現，酪蛋白溶液經過超聲處理后，形成凝膠的pH值降低，彈性和強度增強。超聲輔助適度加熱可以增強酸奶的凝膠結構和持水性，降低凝膠的收縮性[14]。Tang Chuanhe等[15]發現高場強超聲能夠提高商用大豆分離蛋白的溶解性和凝膠性。Zisu等[16]對牛奶蛋白質超聲處理后，發現超聲能夠降低乳清蛋白和酪蛋白的黏性，并增強其凝膠性。

目前，對超聲影響蛋白質凝膠特性的研究多集中在單一分離蛋白質理化性質的變化等方面，而蛋清是一種混合蛋白質，結構相對復雜，關于超聲改善蛋清凝膠性質的研究鮮見報道。因此，本研究釆用超聲波技術作為改性手段，對蛋清溶液進行超聲處理，分析蛋清蛋白質超聲處理前后的空間結構、分子分布和流變學性能的變化；然后，制作不同超聲條件處理的蛋清凝膠，通過對蛋清凝膠的保水性、質構特性等進行分析，探索超聲對蛋清溶液形成凝膠的影響。研究結果可為利用超聲改善蛋清的凝膠性能提供參考，對雞蛋清產業化利用具有一定的指導和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋購自于南昌市天虹商場。

考馬斯亮藍G250、牛血清白蛋白（均為分析純）生工生物工程（上海）股份有限公司；5,5’-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

XO-1000D超聲波細胞破碎儀 江蘇南京先歐儀器制造有限公司；T18高速分散機 德國IKA公司；Lambda25紫外-可見分光光度計 美國Perkin Elmer公司；J-810圓二色光譜儀 日本分光公司；F-4600熒光分光光度計 日本日立公司；高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；BI-200SM動靜態光散射儀美國布魯克海文儀器公司；迷你型蛋白垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；DHR-2流變儀 美國TA公司；G:BOX凝膠成像系統 英國Syngene公司；TA.XT-Plus質構分析儀英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲處理

手工分離得到鮮雞蛋的蛋清，用高速分散機攪拌（4 200 r/min、55 min），間歇開閉分散機開關，控制蛋清溶液在室溫條件下，靜置1 h后，采用冷凍離心機離心（8 000 r/min，30 min），取上清液進行超聲處理。將超聲波探頭伸入蛋清溶液表面1～2 cm。超聲前，先將盛有蛋清樣品的50 mL離心管放在冰水混合物中靜置20 min，以降低溶液溫度，整個超聲過程中，使蛋清樣品處于冰浴環境下，以避免樣品過熱。設置超聲頻率功率為30 Hz，工作時間7 s，間歇時間3 s。超聲功率分別為0、200、400、600 W，超聲時間分別為0、10、20、30 min，正交處理蛋清溶液，得到超聲處理前后的一系列樣品。

1.3.2 粒徑分析

將超聲處理前后的蛋清稀釋至1 mg/mL，經0.45 μm濾膜過濾，設置測量波長為633 nm，入射光路中的衰減輪為50%檔，散射角為90°，小孔徑片為200 μm，測試時間為5 min[17-18]。樣品平行測量3 次。

1.3.3 流變學分析

整個過程根據Nyemb等[19]的研究有所調整，設置儀器應變為1%，振動頻率在0.1～100 Hz范圍內以對數增加，測量超聲處理前后的蛋清的儲能模量（G’）、耗能模量（G’’）和相位角（θ）與振動頻率的關系。

1.3.4 結構分析

1.3.4.1 一級結構的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）對超聲處理前后的蛋清的蛋白質條帶進行分析，按照不連續SDS-PAGE配方配制分離膠和濃縮膠，待凝膠凝固后，取樣品和上樣緩沖液等體積混合，每孔上樣量為10 μg。電泳后，在G:BOX凝膠成像系統上分析得到凝膠圖。

1.3.4.2 二級結構的測定

將樣品稀釋成0.5 mg/mL，設定掃描范圍為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，光徑為0.1 cm，間隔0.1 nm，帶寬0.1 nm，平行測2 次。通過在線圓二色譜分析網站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/ho.shtml）對數據進行分析計算，結果以平均摩爾橢圓率[θ]表示，單位為（deg·cm2）/dmol。

1.3.4.3 內源性熒光光譜分析

將超聲處理前后的蛋清稀釋至0.1 mg/mL，設定熒光分光光度計的條件為：激發波長為350 nm，發射波長為300～400 nm，應答時間為4 s，狹縫寬度為5.0 nm，電壓為400 V。對樣品的熒光強度進行掃描。

1.3.4.4 紫外-可見分光光譜分析

將超聲處理前后的蛋清稀釋至0.1 mg/mL，設置掃描波長范圍為250～350 nm，間隔為1.0 nm，掃描速率中等，帶寬為2.0 nm，響應時間為0.2 s。

1.3.4.5 表面疏水性的測定

將超聲處理前后的蛋清用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）稀釋至0.1 mg/mL，分別取5 mL加入30 μL ANS溶液（5 mmol/L）混合，室溫下避光反應1 h后，測其熒光強度。設定熒光分光光度計的條件為：激發波長為390 nm，發射波長為400～700 nm，掃描速率為1 200 nm/min，光徑為1 cm，狹縫寬度為5 nm，電壓為700 V。

1.3.4.6 游離巰基含量的測定

采用Ellman法測定超聲處理前后的蛋清的游離巰基含量[20-21]。將樣品用三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸（Tris-glycine）緩沖液稀釋成4 mg/mL，將4 mg DTNB溶于1 mL Tris-glycine緩沖液配成Ellman試劑，分別取3 mL稀釋后的樣品溶液與30 μL Ellman試劑混合，室溫下避光反應15 min后，在412 nm波長處測定吸光度，以Tris-glycine緩沖液作為空白對照，按照公式（1）計算游離巰基含量。

式中：75.53＝106/（1.36×104），1.36×104表示摩爾消光系數（mol/（L?cm））；ρ表示蛋白質樣品的質量濃度/（mg/mL）；D表示樣品稀釋倍數（7.5）。

1.3.5 凝膠性質的分析

將超聲處理前后的蛋清90 ℃水浴加熱30 min，制成蛋清凝膠[22]，冷卻，妥善保存，確保其完整性。

1.3.5.1 凝膠保水性的測定

用離心法測凝膠保水性[23]，并做適當修改。取2 g蛋清凝膠用濾紙制成小包，置于10 mL EP管中。8 000 r/min離心20 min，倒去水分，并小心用濾紙轉移殘存的水分，稱質量，實驗重復3 次，凝膠保水性按式（2）進行計算。

式中：m1表示離心前凝膠和離心管的質量/g；m2表示離心后去除水分的凝膠和離心管的質量/g。

1.3.5.2 質構特性的測定

用質構儀測量蛋清凝膠的質構特性[24-25]。采用P/5探頭對樣品進行兩次壓縮。測定條件如下：測前速率：5.0 mm/s；探頭以1.0 mm/s的速率穿刺；測后速率：5.0 mm/s；測定距離為15 mm；壓縮比例為50%；觸發力：5.0 g；觸發類型：Auto；數據攫取速率：200 pps；停留時間：5 s。每個樣品制3塊凝膠，平行測量3 次。

1.4 數據分析

所有數據利用Microsoft Excel 2010軟件進行統計處理，采用Origin 9.0軟件進行作圖分析，用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析，用S-N-K法進行多重比較（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 超聲對蛋清溶液粒徑大小及其分布的影響

利用動靜態光散射分析超聲對蛋清溶液粒徑大小及其分布的影響（圖1），與未超聲的樣品相比，隨著超聲功率的增加和超聲時間的延長，蛋清溶液粒徑主峰不斷左移，粒徑分布范圍變窄，說明超聲使蛋白質的整體分子粒徑分布變窄。與未超聲樣品相比，超聲200 W、20 min和30 min的樣品在20 nm以下的粒徑分布消失，而在28～40 nm范圍內出現了新的粒徑次峰；超聲400 W、10 min和30 min的樣品的粒徑分布分別在15 nm和20 nm以下消失，均在30～50 nm范圍內出現了新的粒徑次峰，說明在200 W和400 W的超聲處理下，蛋清溶液的蛋白質發生了聚集，也有小部分發生了降解。與未超聲樣品相比，在超聲600 W條件下，超聲10、20、30 min的樣品分別在55、45、42 nm以下沒有粒徑分布，且在65～90、55～85、55～82 nm范圍內出現了新的粒徑次峰，說明在600 W的超聲處理下，蛋清溶液的蛋白質發生了部分的降解，也有小部分發生了聚集。

圖1 超聲處理的蛋清樣品粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of egg white samples after ultrasonic treatment

2.2 超聲對蛋清溶液流變性的影響

G’表示樣品在發生形變時，由于彈性形變（可逆）而儲存的能量，大小與凝膠的彈性有關，G’’表示樣品在發生形變時，由于黏性形變（不可逆）而損耗的能量，大小與液體的黏性有關[26]。G’和G’’的比值稱為損耗角正切（tan θ），表示黏彈性的度量，tan θ越大，黏性越大，tan θ越小，彈性越大[27]。溶液在形成凝膠的過程中，G’和G’’一直在發生變化。形成凝膠之初，G’＜G’’，溶液主要發生黏性形變，呈液態；隨著交聯反應的進行，分子基團逐步增大，G’顯著上升，直到G’＝G’’，此時稱為膠凝點，溶液形成半固體的凝膠態；膠凝點之后，G’＞G’’，半固體的樣品發生彈性形變，呈固態[28]。

如圖2C所示，與未超聲樣品相比，經過600 W、30 min的超聲處理后，tan θ增大，黏性變大，說明蛋白溶液表現出更加偏向液體的流變性，黏性越來越大，形成的凝膠彈性較差；同時，與未超聲樣品相比，在同一振動頻率下，600 W、30 min超聲處理組樣品的G’、G’’明顯降低，可能是600 W、30 min處理組樣品發生了一定的降解，蛋清溶液的粒度減小，此推測與動靜態光散射結果符合，從而形成凝膠的交聯程度降低，凝膠性能下降。

如圖2A、C所示，隨著振動頻率增加，200 W、10 min超聲處理組G’顯著下降，tan θ增大，說明蛋白溶液形成的凝膠彈性降低，黏性增大，類似于600 W、30 min超聲處理的樣品，蛋白溶液也偏向液體的流變性，但由于超聲的強度此時并不高，可能是由于蛋清溶液的蛋白質種類繁多且組成復雜，導致200 W、10 min的超聲處理后蛋清液的部分蛋白質更偏向于溶液的黏性。說明蛋清作為混合蛋白源，蛋清中的蛋白質種類和組成在超聲處理下發生的變化也會影響蛋清溶液的流變性。

圖2 超聲處理的蛋清樣品的流變性變化Fig.2 Variation in rheological properties of egg white samples after ultrasonic treatment

2.3 超聲對蛋清溶液空間結構的影響

通過SDS-PAGE分析超聲對蛋清蛋白條帶的影響（圖3），發現蛋白樣品經過超聲處理之后，蛋白質條帶沒有明顯的變化，說明超聲對蛋白質的一級結構并不造成影響。

圖3 超聲處理的蛋清樣品的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE patterns of egg white samples after ultrasonic treatment

圖4 超聲處理的蛋清樣品圓二色光譜Fig.4 Circular dichroism spectra of egg white samples after ultrasonic treatment

利用圓二色光譜分析超聲對蛋清蛋白二級結構的影響，由圖4可知，未超聲樣品在195 nm波長處有正峰，在219～221 nm波長處有負峰，說明未超聲樣品的二級結構以β-折疊為主。超聲處理后，光譜曲線與X坐標軸的交點沒有明顯遷移，大部分在192 nm波長處有一個正峰，在208 nm和222 nm波長處有負峰，表明超聲處理后，蛋清樣品的二級結構主要以β-螺旋結構為主，但部分超聲的蛋清溶液仍表現以β-折疊結構為主的特征峰。蛋清溶液的蛋白質分子主要是β-折疊結構，在超聲處理下，隨超聲時間的延長，蛋清溶液的β-螺旋結構和β-折疊結構出現了無規則變化。說明超聲處理下，部分蛋清溶液的蛋白質二級結構發生改變。

分析超聲對蛋清蛋白三級結構的影響，如圖5A～C所示，在200 W和400 W的超聲處理下，蛋清溶液的熒光強度均降低（圖5A），暴露在溶液中的芳香族氨基酸殘基減少（圖5C），而游離巰基含量在超聲10 min和20 min顯著減少（P＜0.05）（圖5D），超聲30 min無顯著性變化（P＞0.05），疏水基團增加（圖5B）。可能是由于超聲的空穴作用導致蛋白質發生碰撞后相互作用，蛋白質發生卷曲、折疊，使部分生色基團被包裹在蛋白分子內部，導致熒光強度部分猝滅，蛋白質發生折疊時，蛋白質部分聚集，蛋白質分子間的芳香族氨基酸殘基、疏水基團和游離巰基被部分掩埋，巰基形成了二硫鍵，因此暴露在溶液中的芳香族氨基酸殘基和游離巰基含量下降；而疏水基團增加可能是由于蛋白質發生聚集時，分子間相互作用，暴露出分子內的疏水基團。

如圖5A～C所示，在600 W的超聲作用下，相對于未處理的蛋清樣品，超聲10 min的熒光強度明顯降低，超聲20 min和30 min的熒光強度（圖5A）和暴露在溶液中的芳香族氨基酸殘基（圖5C）、疏水基團增加（圖5B），游離巰基含量顯著增加（P＜0.05）（圖5D），可能是蛋白質分子相互作用，暴露出不同的生色基團。相比于超聲20 min和30 min的樣品，超聲10 min的樣品的熒光強度反而低于未處理樣品，可能是由于蛋清溶液是混合蛋白源，分子結構復雜、熒光生色基團分布不均、蛋白質分子伸展和折疊方式不同，在超聲處理下都會引起蛋白熒光強度的差異[29]，蛋白質部分展開時，蛋白質分子結構由緊密變得松散，暴露在溶液中的芳香族氨基酸殘基越來越多，蛋白質的分子間疏水作用也被破壞，分子內部暴露出了更多的疏水基團，包埋在蛋白質內部的巰基暴露到分子表面，同時分子間或分子內的二硫鍵被打斷，形成了新的巰基。

圖5 超聲處理的蛋清樣品三級結構變化Fig.5 Change in tertiary structure of egg white samples after ultrasonic treatment

2.4 超聲對蛋清凝膠特性的影響

由圖6A可知，在超聲200 W時，和超聲0 min相比，超聲處理使蛋清凝膠保水性顯著增加（P＜0.05），但超聲10 min和20 min之間無顯著性變化（P＞0.05）。在超聲400 W時，超聲10 min保水性無顯著性變化（P＞0.05），超聲20 min和30 min的凝膠保水性顯著增強（P＜0.05）。在超聲600 W時，和超聲0 min相比，超聲10、20、30 min均使蛋清凝膠保水性顯著增強（P＜0.05），但超聲10、20 min和30 min處理組之間蛋清凝膠保水性無顯著性變化（P＞0.05）。保水性增強可能是因為超聲波的空穴效應使蛋清溶液的蛋白質發生了一定的折疊和聚集，從而蛋清凝膠形成的空間網絡結構更加均一、穩定，對水分子的綁定更加堅固[30]。Zhang Ziye等[31]發現肌纖維蛋白凝膠在經過超聲處理之后，保水性會增加，因為超聲之后蛋白質溶液更加均一，空隙變小，更容易防止水分子逸出，和本研究結論一致。

由圖6B可知，在200 W和400 W超聲處理下，隨著超聲時間的延長，蛋清的凝膠強度顯著增強（P＜0.05），可能是由蛋白質分子間或分子內發生了一定的交聯反應，蛋白質發生了一定的折疊和聚集，這能導致蛋白質聚集體的相對分子質量增大，而暴露在溶液中的游離巰基含量減少，二硫鍵增多，導致分子間或分子內發生交聯的機會增多，因此蛋清溶液的凝膠強度增強。相反，在600 W、30 min的超聲處理下，蛋清溶液的凝膠強度顯著降低（P＜0.05），可能是長時間的超聲處理使蛋清溶液的蛋白質逐漸展開，并發生了一定的降解，使蛋白質分子間不容易發生交聯反應。Zhang Peipei等[32]在轉谷氨酰胺酶催化大豆分離蛋白的實驗中發現，隨著超聲功率的增大，蛋白質的凝膠強度增加，說明超聲有利于大豆分離蛋白的交聯反應，并能增加氨基酸之間的非共價作用和增強蛋白質凝膠三維網絡結構的穩定性。但本研究發現，與未處理樣品相比，在超聲600 W、30 min的條件下，蛋清蛋白的凝膠強度反而降低了。由此可見，蛋白種類不同，超聲處理對蛋白凝膠結構的影響也不同。

圖6 超聲處理對蛋清凝膠特性的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment on egg white gel properties

3 結 論

超聲可以改變蛋清溶液的粒徑分布，使部分蛋白質分子粒徑變大，部分蛋白質分子粒徑變小。200 W、10 min和600 W、30 min的超聲處理下，蛋清溶液偏向于液體的流變性。在200 W和400 W的超聲處理下，蛋清溶液的蛋白質發生了折疊和聚集，也有小部分發生了降解；在600 W的超聲處理下，蛋清溶液的蛋白質發生了部分的降解，也有小部分發生了聚集。在200、400 W和600 W 3 種功率的超聲處理下，與超聲0 min相比，蛋清凝膠的保水性均增強。200 W和400 W的超聲處理有利于增強蛋清的凝膠強度，使凝膠更加堅固和致密；600 W、30 min的超聲處理會使蛋清的凝膠強度降低，從而使凝膠的穩定性降低。

本研究說明一定強度的超聲處理可以改善蛋白質的凝膠特性，但需要限制超聲處理的強度，高功率和長時間的作用下，蛋白質的凝膠特性可能會降低。前人研究超聲對蛋白質凝膠特性的影響，主要致力于對單一蛋白影響的研究，如大豆7S蛋白、羅非魚分離蛋白等，而在食品加工過程中，蛋白質發揮凝膠特性通常是在復雜的食物基質條件下；因此，研究超聲對單一蛋白凝膠特性的影響具有一定的局限性。本研究以蛋清蛋白這一混合蛋白源為研究對象，對其在超聲前后的理化性質、流變特性及功能特性進行了詳細的探討，研究結果可為進一步改善蛋清制品凝膠特性、充分開發利用我國蛋清資源提供參考。