超高壓處理對低脂乳化腸水分分布及微觀結構的影響

白 云，莊昕波，孫 健，徐幸蓮，周光宏,*

（1.南京農業大學 江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

加工肉制品由于具有營養美味、食用方便等特點深受消費者喜愛，其富含蛋白質和微量元素。但是，加工肉制品同樣含有大量的飽和脂肪酸和膽固醇。以乳化腸為例，其含有高達30%的動物脂肪。過多的脂肪攝入會導致各種疾病的發生，例如肥胖、高血壓、心血管疾病和冠心病等[1]。因此，降低脂肪含量是當前肉制品加工行業急需解決的問題之一。在肉制品加工過程中，水分占據了舉足輕重的地位，水分子的存在形式和分布狀態決定了乳化腸的保水性、出品率及貨架期等。乳化腸中加入脂肪的作用就是提高其多汁性和保水性，使其蒸煮之后不會過分收縮，從而具有光滑、細膩的口感[2]。目前國內外研究普遍采用脂肪替代的手段來降低脂肪含量，而消費者追求肉制品營養天然的需求則對打破常規脂肪替代法來實現降脂提出了要求[3-4]。然而，不采用脂肪替代，單一調整脂肪和水的比例來降低產品中的脂肪含量會導致最終產品保水性差，出水出油現象嚴重，影響消費者對產品的接受程度。

超高壓技術（high pressure processing，HPP）是一種新型非熱殺菌技術，其因具有殺菌、滅酶、延長貨架期及改善產品質構等特點而被廣泛應用在多個研究領域[5]。相關文獻報道超高壓技術可以降低肉制品中的鹽含量[6-10]。但是關于利用超高壓技術改善低脂乳化腸的保水性和凝膠結構的研究還比較少。

本研究通過測定不同壓強（0.1、100、200、300 MPa）處理后低脂乳化腸的保水性、低場核磁和微觀結構，以研究超高壓技術能否改善低脂乳化腸保水性以及超高壓技術對蛋白凝膠結構的影響和凝膠結構與水分分布的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料選用優質豬背最長肌及豬背膘，輔料如食鹽、糖、三聚磷酸鈉、白胡椒粉等均購于南京市農貿市場；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SIM-F124制冰機 日本三洋公司；TE412-L電子天平 德國賽多利斯公司；UMC-5C斬拌機 德國Stephan公司；S-IL-100-850-9-W高壓設備 英國Stansted公司；TA-XT Plus物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；DC-800真空包裝機 美國希悅爾公司；TW20通用水浴槽 德國Julabo公司；PQ001型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成像分析儀上海紐邁電子科技有限公司；S-3000N掃描電子顯微鏡日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將背最長肌用篩孔直徑為0.8 cm的絞肉機絞碎后真空包裝，分別于100、200、300 MPa處理9 min，0.1 MPa（大氣壓強）處理為對照組，溫度保持在10 ℃。

1.3.2 肉糜制作

參照Lin Kuowei等[11]的方法，并稍加改動。以瘦肉50.0 g、肥膘20.0 g計，其他添加物配比為冰水30.0 g、食鹽1.5 g、糖0.5 g、三聚磷酸鈉0.2 g、白胡椒粉0.3 g。先將肥膘用直徑0.8 cm篩孔的絞肉機絞碎，然后將處理組及對照組瘦肉分別放入斬拌機，1 500 r/min斬拌30 s，斬拌過程中加入食鹽、三聚磷酸鈉和1/3體積冰水，停3 min；再1 500 r/min斬拌30 s，斬拌過程中加入其他輔料、豬背膘和1/3體積冰水，停3 min；最后3 000 r/min斬拌60 s，斬拌過程中加入1/3體積冰水，使中心溫度低于10 ℃。

1.3.3 乳化腸制作

將25.0 g肉糜放入50 mL離心管中，80 ℃水浴加熱20 min，之后4 ℃冷藏。

1.3.4 保水性的測定

參照Kang Zhuangli等[12]的方法，并稍加改動。稱取25.0 g生肉糜至50 mL離心管中，500×g離心15 min以去除肉糜中的氣泡。之后將離心管放入80 ℃水浴中加熱20 min。取出后將離心管倒置放于干燥皿（提前稱質量m1）中，在室溫下放置50 min后，稱取干燥皿的質量m2。保水性按式（1）計算。

1.3.5 NMR橫向弛豫時間（T2）的測定

將乳化腸置于室溫（25 ℃）平衡30 min后，直接切取2.0 g（勿切碎）放入直徑15 mm的核磁管中進行測試。采用低場NMR弛豫CPMG序列測試，具體條件參照文獻[13]：溫度32 ℃，磁場強度0.5 T，共振頻率22 MHz，開始采樣時間的控制參數為80 μs，重復采樣16 次，半回波時間250 μs，重復間隔時間6 s，得到回波13 000 個。獲得的數據采用MultiExp Inv Analysis軟件進行反演[14]，得到T2。反演數學模型如式（2）所示。

式中：A（t）為衰減到時間t/ms時的振幅；A0i為第i個組分平衡時的振幅；T2i為第i個組分的自旋-自旋弛豫時間/ms。

1.3.6 微觀結構觀察

參照Feng Xianchao[15]和Bian Guangliang[16]等的方法，并稍加改動。使用掃描電子顯微鏡進行樣品微觀結構的觀察，制樣方法為：將乳化腸切塊（約3 cm3）后放入質量分數2.5%戊二醛溶液中固定24 h，之后切成1 cm3小塊，經過漂洗（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）、固定（質量分數1%四氧化鋨）、漂洗、脫水（乙醇）、冷凍干燥、噴金，用掃描電子顯微鏡拍照。

利用Image J軟件對掃描電子顯微鏡圖片進行二維化處理，一般在凝膠網絡結構體系中形成的孔徑小于1 μm，而圖形統計分析時的單位為pixel，因此根據圖片中的比例尺和軟件統計分析單位（pixel）按比例換算，得出對應直徑小于1 μm孔穴中對應于統計單位pixel的面積，從而進行統計分析。

1.4 數據處理與分析

所有實驗重復4 次，應用SPSS 20.0軟件進行分析，先進行一般描述性統計，再進行方差分析（用Duncan’s新復極差法進行多重比較），以P＜0.05表示差異顯著。用Rstudio 3.5.0軟件中FactoMiner分析包進行主成分分析[17]，并使用Factoextr分析包進行主成分分析結果的可視化處理。

2 結果與分析

2.1 不同壓強處理對低脂乳化腸保水性的影響

圖1 不同壓強對低脂乳化腸保水性的影響Fig.1 Changes in water-holding capacity of low-fat emulsion sausages subjected to HPP treatments

如圖1所示，乳化腸的保水性隨著壓力的變化呈顯著差異（P＜0.05）。和對照組相比，經過高壓處理的低脂乳化腸保水性隨著壓強的升高而顯著增大；當作用壓強增加到200 MPa時，乳化腸的保水性提高至最高值96.51%；但是當作用壓強超過200 MPa達到300 MPa時，乳化腸的保水性反而下降，與對照組差異不顯著，達到90.18%。實驗數據顯示200 MPa的作用壓強是改善低脂乳化腸保水性的最大壓強。

本研究結果與馬亞萍等[18]的結果基本一致，其發現添加了卡拉膠的雞胸肉肉糜經高壓處理后，其蒸煮損失率及水分損失率隨著壓強升高而減小，在200～400 MPa處理時達最低值后，又隨著壓強升高逐漸增加。Yang Huijuan等[19]的研究同樣發現經過200 MPa高壓處理2 min，乳化腸的保水性和多汁性得到顯著的改善。這可能是因為高壓處理可以提高肌原纖維蛋白的溶解性，在后續的加熱過程中，有更多的肌原纖維蛋白疏水基團暴露出來，發生疏水交聯，形成更加穩定的三維網絡結構，從而提高了乳化腸最終的保水性[20]。但是當作用壓強超過200 MPa時，乳化腸的保水性下降，其原因可能是在300 MPa處理時，高壓作用導致肌球蛋白分子聚集，其結構過度變性，進而在加熱過程中抑制了凝膠網絡結構的形成，使其保水性下降[21]。

2.2 不同壓強處理對低脂乳化腸弛豫特性的影響

圖2 低脂乳化腸的低場NMR橫向弛豫時間T2Fig.2 T2 relaxation times of water states in low-fat emulsion sausages

肌原纖維蛋白凝膠中的水分主要包括自由水、不易流動水和結合水3 種形態[22]。自由水代表凝膠中能夠自由流動、存在于凝膠表面的水，通常是指熱誘導凝膠過程中流失的水分；不易流動水是束縛于肌原纖維蛋白凝膠網絡結構中的水分，約占總水分的80%；結合水是指與大分子緊密結合的一部分水分子[23]。橫向弛豫時間T2可以反映樣品中水分子的自由度，其弛豫時間的變化可以用于表征經不同壓強預處理乳化腸中水分分布的情況，即水分分布狀態和自由移動程度；弛豫峰面積比例可以反映各種狀態水分的相對含量，其變化情況可以表征經不同壓強預處理的乳化腸中3 種分布狀態水分含量變化情況[24-25]。由圖2可知，低脂乳化腸T2呈現3 個峰，其對應的橫向弛豫時間分別為：0～3（結合水，T2b）、50～100（不易流動水，T21）、300～600 ms（自由水，T22）。

表1 不同壓強對低脂乳化腸橫向弛豫時間T2的影響Table1 Effect of HPP on T2 relaxation time of water from low-fat emulsion sausages

由表1可知，高壓處理對低脂乳化腸的結合水T2b無顯著影響。但是高壓處理顯著影響了乳化腸中不易流動水T21，隨著高壓作用力的增加而呈現先升高后降低的趨勢。T21越小，說明蛋白凝膠三維網絡結構對不易流動水的束縛能力越強；反之，T21越大，束縛能力越差。因此，高壓處理會導致凝膠結構中不易流動水的束縛能力顯著變差，尤其在200 MPa處理時，T21最大，為85.67 ms。楊慧娟等[26]在研究通過高壓處理改善低脂低鹽乳化腸的品質時發現了同樣的現象。此外，低脂乳化腸中自由水T22受高壓作用影響較小，呈不規則變化，這可能與自由水不受到外界束縛有關。

表2 不同壓強對低脂乳化腸的橫向弛豫峰面積比例的影響Table2 Effect of HPP on peak area fraction of water from low-fat emulsion sausages

由表2可知，與對照組相比，不同高壓處理顯著影響了結合水和不易流動水的橫向弛豫峰面積比例（P＜0.05）。隨著壓強的升高，乳化腸中結合水的峰面積比例（P2b）顯著提高，說明在高壓作用下肌原纖維蛋白基團會和水分子發生水合作用。不易流動水的峰面積比例（P21）在200 MPa處理時達到最大值，說明經該高壓條件處理的乳化腸能夠束縛最大量的不易流動水。自由水的峰面積比例（P22）在0.1～200 MPa范圍內隨著壓強的增加顯著下降（P＜0.05），從對照組的10.71%下降到200 MPa處理組的3.99%。由此可知，高壓處理會顯著影響水分分布情況，隨著壓強的增加，自由水相對含量降低，而結合水和不易流動水的相對含量升高，說明超高壓處理能使乳化腸中的自由水向結合水和不易流動水轉化。

2.3 不同壓強處理對低脂乳化腸微觀結構的影響

圖3 超高壓作用對低脂乳化腸顯微結構的影響（×2 000）Fig.3 Changes in microstructure of low-fat emulsion sausages subjected to HPP treatments (× 2 000)

由圖3可知，高壓處理顯著影響蛋白凝膠網絡結構。對照組凝膠網絡結構致密，但是其中存在水壑，將凝膠整體分割呈片狀或區域化。經過高壓處理后，凝膠網絡結構變得多孔疏松，呈海綿狀結構，存在大量的水穴。尤其是200 MPa處理組的凝膠網絡結構中孔狀海綿結構最多、最大，可以束縛大量的水分，因此200 MPa處理組低脂香腸具有最好的保水性。當處理壓強增加到300 MPa時，凝膠網絡結構重新變得致密、緊湊，孔狀結構變小，數量減少，但是結構整體沒有像對照組一樣呈片狀化。為了更好地對蛋白凝膠微觀變化差異進行量化和客觀分析，利用Image J軟件對掃描電子顯微鏡圖片進行二維化處理，測量凝膠結構中孔隙的大小和數量[27]。由表3可知，2 0 0 M P a處理組的孔徑和數量分別是484.2 pixel2和399 個，顯著大于對照組的孔徑和數量（342.7 pixel2和177 個）。因此，高壓處理可以改善蛋白凝膠中孔狀海綿結構，使孔變大、增多，以便束縛更多的水分于其孔隙中，這一現象在200 MPa處理時尤為明顯。陸海霞等[28]同樣發現在合適的壓強處理條件（300、400 MPa）下，肌原纖維蛋白凝膠可以形成均勻的網絡結構，但當壓強繼續增大時，凝膠中出現了大的凝結塊。其作用壓強比本研究大，可能是由于他們的研究中肌原纖維蛋白凝膠未經加熱處理，僅使用超高壓成膠。

表3 不同壓強對低脂乳化腸的網絡結構孔徑和數量的影響Table3 Effect of HPP on particle size and number of cavities in microstructure of low-fat emulsion sausages

2.4 低脂乳化腸保水性、水分分布和微觀結構主成分分析

蛋白凝膠的微觀結構直接影響其最終的理化特性，例如保水性和凝膠強度等。缺少對凝膠微觀結構的量化分析將無法客觀分析微觀結構和理化特性的相關性。本研究通過測定水分孔隙大小和數量來間接反映凝膠的微觀結構，為分析微觀結構和理化特性的相關性提供了可能。同時，利用主成分分析軟件評估保水性、弛豫特性和微觀結構之間的相關性。圖4、5是主成分分析的結果，第1主成分貢獻率為66.96%，第1主成分和第2主成分的總貢獻率為82.83%，說明保水性、弛豫特性和微觀結構之間存在很強的相關性。從載荷圖中可以發現：孔徑、數量、總面積、保水性、P21、T21與第1主成分呈正相關，P22與其呈負相關；第2主成分中T22和P2b與其呈正相關。從散點圖中發現，4 個處理組呈現離散狀態，彼此之間沒有重合。這說明超高壓處理顯著影響了最終乳化腸的保水性、水分分布狀態和微觀結構。而從第1主成分（微觀結構和保水性）分析可知，4 個處理組主要分成3 類：200 MPa處理組、100 MPa處理組與0.1、300 MPa處理組。說明0.01 MPa處理組和300 MPa處理組的微觀結構和保水性相似，而200 MPa處理組和100 MPa處理組的微觀結構和保水性發生了明顯變化。發生以上現象的原因可能是超高壓處理使得低脂乳化腸凝膠結構中孔徑和數量顯著增加，從而提高了低脂乳化腸的保水性，但是孔隙結構的增加也導致凝膠結構對水分束縛能力的下降（T21增加）。超高壓處理提高低脂乳化腸持水能力的最佳壓力為200 MPa，其提高低脂乳化腸保水性的原因是：一方面，超高壓能促使水分子和蛋白質基團發生聚合作用，讓不易流動水填補到蛋白質氨基酸側鏈周圍而變成結合水，同時蛋白質大分子鏈在高壓作用過程中發生構象變化，也會利于極性親水基團暴露與水分子的結合，實驗結果顯示超高壓處理可以顯著提高凝膠體系中結合水的比例[29]；另一方面，超高壓處理可以提高肌原纖維蛋白的溶解性，這樣在后續的加熱過程中，有更多的肌原纖維蛋白疏水基團暴露出來，進而發生疏水交聯。此外，文獻[30-31]也報道這可能是由于高壓處理可以促進蛋白分子局部變性解聚，疏水殘基周圍形成網絡結構，該結構有利于水分子的束縛。

圖4 變量與主成分間的相關性（載荷圖）Fig.4 Correlation among variables and principal components (loading plot)

圖5 不同壓強處理樣品主成分評分（散點圖）Fig.5 Principal component score scatter plot for HPP-treated samples at different pressures (scatter plot)

3 結 論

經超高壓處理的乳化腸體系中水分子的分布狀態發生顯著變化。隨著作用壓強從0.1 MPa（大氣壓強）增加到300 MPa（尤其在200 MPa時），乳化腸凝膠體系中結合水與肌肉蛋白的結合程度增強，自由水向不易流動水和結合水轉化，提高了乳化腸的保水性。主成分分析發現乳化腸保水性和凝膠微觀結構顯著相關，超高壓處理顯著影響乳化腸微觀結構中孔徑和數量以及水分分布。