原花青素A2腸道菌群代謝物及其抗氧化活性

楊光美，李桐云，張玉瑩，楊瑞麗，李 武*

（1.海南大學食品學院，海南 海口 570228；2.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

原花青素是一類由兒茶素和（或）表兒茶素為單位聚合而成的多酚化合物，具有抗氧化[1]、抗炎[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抗動脈粥樣硬化[5]等多種生物活性。原花青素根據其單體聚合度（degree of polymerization，DP）可以分為單體（DP＝1）、寡聚體（DP＝2～10）和多聚體（DP＞10）；根據其組成單位間連接的方式可以分為A型和B型原花青素。其中，以C4－C8或C4－C6鍵（B鍵）為連接方式的原花青素為B型；除C4－C8或C4－C6鍵外，還具有C2－O－C7或C2－O－C5鍵（A鍵）連接的原花青素為A型。A型原花青素的結構組成相對于B型更為復雜。其中，原花青素A2（procyanidins A2，PCA2）是由表兒茶素聚合而成的A型原花青素二聚體，目前報道的主要來源有荔枝果皮[6]、花生紅衣[7]、鱷梨[8]及蔓越莓[9]等。

研究發現，人體攝入的多酚約95%不能被小腸直接吸收，而是進入結腸，經腸道菌群代謝分解為更易被人體吸收的酚酸等小分子物質[10]。藍莓原花青素腸道菌群代謝物能夠顯著提高巨噬細胞三磷酸腺苷結合盒轉運體A1的表達，降低腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6的分泌[11]。鞣花單寧具有顯著的抗氧化和抗炎癥活性，但是鞣花單寧的消化吸收率極低，而其腸道菌群代謝物尿石酸容易吸收，同時也具有顯著的抗氧化和抗炎癥活性[12]；（－）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯的腸道菌群代謝物也顯示出比其原型更高的抗氧化活性[13]。Appeldoorn等[14]采用大鼠原位腸道灌流發現，PCA2的直接吸收率只有0.1%。原花青素腸道菌群代謝物可能在其生物活性作用過程中起著重要的作用[15]。因此，明確PCA2腸道菌群代謝物的組成與活性，可能對于闡明原花青素生物活性作用機制具有重要意義。Engemann等[16]的研究顯示PCA2的豬腸道菌群代謝物主要為3-（4-羥苯基）丙酸和3-（3-羥苯基）丙酸；但是其代謝產物的活性分析鮮見報道。因此，本實驗采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜聯用（ultra performance liquid chromatographyquadrupole-time-of-flight-tandem mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）儀對PCA2腸道菌群代謝物的組成進行了分析，并比較了其代謝產物的抗氧化活性，結果可以為原花青素腸道菌群代謝物的組成與活性研究，以及原花青素的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD雄性大鼠，購于廣東省動物實驗中心（許可證編號：SYXK（粵）2014-0136）。

新鮮荔枝（品種：懷枝，產期2016年），購于廣州從化荔枝園；PCA2采用荔枝果皮為原料提取純化獲得，經高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測其純度為94.08%。

厭氧培養基 廣州健陽生物技術有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A型HPLC儀 日本島津公司；1290-6540 UPLC-MS聯用儀 美國Agilent公司；YQY-1厭氧培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；Multiskan Mk3型多功能酶標儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 PCA2體外腸道菌群代謝

參照Engemann等[16]的方法，將SD大鼠麻醉，解剖取盲腸、結腸內容物，無菌生理鹽水稀釋（1∶4，m/V），4 層無菌紗布過濾，體積比1∶9接種于厭氧培養基，以滅菌樣品作為對照。5.4 mL腸道菌懸液加入0.6 mL 0.3 mg/mL PCA2，混合均勻后，迅速吸取1.0 mL加入滅菌離心管，37 ℃厭氧培養。在培養0、6、12 h和24 h時取樣，－80 ℃保存待測。

1.3.2 腸道菌群代謝物HPLC分析

樣品加入等體積乙酸乙酯萃取3 次，合并酯相，氮氣吹干后用1.0 mL甲醇溶解，0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC分析。

HPLC分析條件：LC-20A型HPLC系統，SPD-20A檢測器；InertSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。柱溫30 ℃，上樣體積20 μL，流速0.8 mL/min。流動相A：體積分數0.2%甲酸溶液，流動相B：乙腈。梯度洗脫程序：0～10 min，5%～15% B；10～20 min，1 5%～2 5% B；2 0～4 0 m i n，25%～45% B；40～50 min，45%～80% B。檢測波長：280 nm。

1.3.3 腸道菌群代謝物UPLC-TOF-MS/MS分析

MS條件：ESI負離子源模式，毛細管電壓3 500 V，碎片電壓150 V，霧化壓力65 Psi，干燥氣體溫度325 ℃，離子范圍m/z 100～1 100。

1.3.4 腸道菌群代謝物抗氧化活性測定

各時間點樣品采用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，合并酯相氮氣干燥，采用下述方法進行抗氧化活性分析。

1.3.4.1 T-AOC測定

參照T-AOC試劑盒步驟進行?？寡趸镔|可以將Fe3+還原成Fe2+，后者與啡啉類物質形成穩定的絡合物，520 nm波長處比色確定其抗氧化能力。

1.3.4.2 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率參照李斌等[17]的方法，配制2.5 mmol/L DPPH的無水乙醇儲備液，4 ℃避光保存備用。使用時再用無水乙醇稀釋，制備0.15 mmol/L的DPPH工作液。50 μL適當稀釋的待測樣品加入等體積的DPPH工作液，微量振蕩器混勻后，避光反應30 min。515 nm波長處測定樣品OD值（ODi）；以無水乙醇代替DPPH溶液，其OD值記為OD0；以無水乙醇代替樣品，其OD值記為ODj。按下式計算DPPH自由基清除率。

1.3.4.3 清除ABTS+?能力的測定

參照周瑞等[18]的方法，將ABTS（7 mmol/L，5 mL）和過硫酸鉀溶液（140 mmol/L，88 μL）混合，室溫避光反應12 h，制備ABTS+?儲備液。檢測時，儲備液調整為OD734nm為0.70±0.02的工作液。20 μL適當稀釋的樣品中加入200 μL ABTS+?工作液，振蕩混勻30 s，734 nm 波長處測定其OD值（ODi）。以同等體積的試劑（OD0）、無水乙醇（ODj）為對照。按1.3.4.2節公式計算其清除率。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 PCA2的腸道菌群代謝

圖1 PCA2質量濃度隨時間變化曲線Fig.1 Degradation curve of PCA2 by rat intestinal microflora

由圖1可知，培養前6 h PCA2被腸道菌群代謝較快，6 h時PCA2的含量降低77.28%；6 h后PCA2的代謝速率開始下降，在12 h和24 h PCA2的含量分別降低84.99%和90.07%。滅活菌群培養24 h PCA2含量無明顯變化。

2.2 腸道菌群代謝物HPLC分析

從圖2可見，PCA與腸道菌群共培養6 h后，有8 種主要新化合物生成。在培養12 h時，化合物3、4、8的含量明顯增加，而化合物7沒有被檢測到。培養24 h時，新生成化合物相對含量與12 h時相比無顯著變化。

圖2 PCA2在不同代謝時間的HPLC圖Fig.2 HPLC analysis of PCA2 at different incubation times with rat intestinal microbiota

2.3 腸道菌群代謝物UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

表 1 PCA2腸道菌群代謝物UPLC-Q-TOF-MS/MS結果Table1 PCA2 metabolites determined by UPLC-Q-TOF-MS/MS

經質譜數據庫比對與分析的結果顯示（表1），PCA2經腸道菌群代謝生成的化合物1的分子離子峰為151.02[M－H]－，主碎片峰分別為108.07、112.99、119.94，推斷該化合物為對羥苯基乙酸。該化合物可能為PCA2中的C—O—C鍵斷裂，產生B型原花青素中間產物，中間產物C—C鍵斷裂，生成表兒茶素，表兒茶素A環裂解失去相對分子質量為44的[COO]－基團，同時發生β-氧化反應，生成分子離子峰為151.02[M－H]－的羥苯基乙酸化合物[19-20]；van’t Slot等[21]的報道也顯示，原花青素B2經腸道菌群代謝產生的151.02[M－H]－化合物為對羥苯基乙酸。

代謝物2的分子離子峰為289.07[M－H]－，碎片峰分別為137.02、165.02、205.05、245.08等。碎片峰137.02和165.02為表兒茶素C環1、3鍵斷裂和1、2鍵斷裂產生；碎片峰205.05為表兒茶素B環失去2個C2H2O基團產生；碎片峰245.08為表兒茶素A環失去[COO]－基團產生，推斷該化合物為表兒茶素[22]。

代謝物3的分子離子峰為165.06[M－H]－，碎片峰分別為107.03、121.07、149.01、151.01等。其中，碎片峰149.01為該化合物失去氧原子產生，149.01[M－H]－為3-苯基丙酸的特征離子峰；碎片峰121.07為該化合物失去[COO]－基團產生，121.07[M－H]－為苯甲酸的特征離子峰。分子離子峰165.06[M－H]－為3-（4-羥苯基）丙酸的特征離子峰，碎片峰主要有121.07、107.05、151.01、138.02等[23-24]。文獻顯示，芒果和香蕉中的黃酮類和酚類物質經微生物代謝后生成3-（4-羥苯基）丙酸[25]。

代謝物峰4的分子離子峰為577.13[M－H]－，碎片峰分別為541.15、424.86、291.09、535.20等。該化合物相對于PCA2分子離子峰的m/z增加了2，由PCA2水解產生。碎片峰541.15為失去兩分子H2O產生；碎片峰424.86為該化合物C環裂解發生逆狄爾斯-阿德爾（Retro Diels-Alder，RDA）反應失去C8H8O3的中性基團產生；碎片峰535.20為該化合物B環裂解失去C2H2O基團產生；291.09碎片峰為表兒茶素。577.20為B型原花青素二聚體的特征離子峰，常見的碎片峰有451.10、425.02、407.12和288.90[25]。推斷PCA2經腸道菌群代謝，其C2—O—C7鍵發生斷裂，生成B 型原花青素二聚體[26-27]。

代謝物6的分子離子峰為271.06[M－H]－，碎片峰分別為151.00、119.05。該化合物可能為PCA2 C2—O—C7鍵斷裂生成表兒茶素，表兒茶素再失去一分子H2O產生。碎片峰151.00為該化合物A環斷裂失去[COO]－基團，再失去一個苯環產生；碎片峰119.05為該化合物C環發生RDA反應，失去C8H8O3中性基團產生。質譜數據庫比對與分析結果顯示，該化合物是5,7,2’-三羥基黃烷。

代謝物峰5的分子離子峰為301.04[M－H]－，碎片峰分別為151.00、178.99、245.04。該分子離子峰為PCA2的C環發生RDA反應，失去相對分子質量為152的C8H8O3中性基團和一分子的苯環與[COO]－基團產生。代謝物峰7的分子離子峰為423.07[M－H]－，碎片峰分別為212.97、272.92等。分析為PCA2 C環發生RDA反應，失去C8H8O3中性基團產生。同時，HPLC的結果顯示，該化合物在12 h和24 h消失（圖2），推測該化合物作為中間產物降解生成其他物質。代謝物8的分子離子峰212.04[M－H]－，碎片峰分別為105.03、118.03、168.05、183.03等。其中，碎片峰168.05為失去[COO]－基團產生；推測該化合物為PCA2的C—O—C、C—C鍵斷裂，生成表兒茶素單體中間產物，中間產物再失去一分子苯環產生。代謝產物5、7和8還有待進一步鑒定。

2.4 PCA2腸道菌群代謝物抗氧化活性

2.4.1 代謝產物的T-AOC

圖3 PCA2腸道菌群代謝產物T-AOC的變化Fig.3 T-AOC of PCA2 before and after incubation with rat intestinal microbiota

如圖3所示，隨著培養時間的延長，PCA2腸道菌群代謝產物T-AOC呈現先增加后緩慢下降的趨勢。6、12 h和24 h代謝產物的T-AOC均顯著高于0 h（P＜0.05），分別為0 h的2.01、1.96、1.71 倍；6 h與12 h代謝產物的T-AOC無顯著差異；代謝24 h時，其產物T-AOC降低至6 h的84.53%。

2.4.2 DPPH自由基清除能力

圖4 PCA2腸道菌群代謝產物DPPH自由基清除能力的變化Fig.4 DPPH radical scavenging capacity of PCA2 before and after incubation with rat intestinal microbiota

從圖4可知，6、12 h和24 h代謝產物DPPH自由基清除能力均顯著高于0 h（P＜0.05），6 h DPPH自由基清除能力是0 h的2.16 倍，6、12、24 h代謝產物DPPH自由基清除能力無顯著差異。

2.4.3 ABTS+?清除能力

從圖5可知，隨著代謝時間的延長，PCA2腸道菌群代謝物ABTS+?清除能力呈現先增強后下降的趨勢。6、12、24 h代謝產物ABTS+?清除能力均顯著高于0 h（P＜0.05），分別為0 h的1.34、1.44、1.24 倍；代謝24 h時，其代謝產物ABTS+?清除能力分別降至6 h和12 h的92.35%和85.16%。

圖5 PCA2腸道菌群代謝產物ABTS＋·清除能力的變化Fig.5 ABTS+· scavenging capacity of PCA2 before and after incubation with rat intestinal microbiota

3 結 論

PCA2經腸道菌群體外代謝產生8 種新化合物，包括對羥苯基乙酸、表兒茶素、3-（4-羥苯基）丙酸、B型原花青素和5,7,2’-三羥基黃烷和3 種未知結構化合物。PCA2腸道菌群代謝產物的抗氧化能力顯著高于PCA2，其中代謝6 h時，其T-AOC、DPPH自由基和ABTS+?清除能力分別提高了2.01、2.16、1.34 倍。腸道菌群代謝物可能在PCA2生物活性作用過程中發揮著重要的作用。