黃山毛峰茶多酚提取物對肝藥酶Cyp3a11的調控作用

左 丹，劉 冬，李仕琪，秦亦飛，孫海燕,*，明 建*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.深圳職業技術學院 深圳市發酵精制檢測系統重點實驗室，廣東 深圳 518055）

茶是世界三大飲料之一[1]，茶多酚是茶葉多酚類化合物的總稱。茶葉中含有30多種茶多酚，占茶葉干質量的15%～30%，在茶葉發揮主要生物活性及藥理學活性中起主導作用[2-4]。但民間歷來有“藥茶不能同食”的說法，認為茶能降低藥物療效，然而飲茶對藥物的影響一直未見全面報道，相關作用機制也缺乏全面的實驗證據[5-7]。

肝臟細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）氧化酶是參與大多數臨床藥物、環境致癌物、外源毒物及內源活性物質生物轉化的主要酶系統，其中CYP450 3A4氧化酶（CYP3A4）占肝臟P450氧化酶總量的35%，由于小鼠和人的藥物代謝酶基因具有同源性，小鼠肝Cyp3a11相當于人肝CYP3A4表達[8-9]。大量研究證實，孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）是調控CYP3A4基因表達的關鍵轉錄因子，它是核受體（nuclear receptors，NRs）超家族中的重要成員，內外源化合物通過激活PXR介導的信號通路調節CYP3A4表達是影響物質在體內代謝的重要途徑[10]。其機制為：當PXR被內源性和外源性化合物激活后，構象發生改變，并與視黃醇X受體（retinoid X receptor，RXR）結合形成異源二聚體，在某些輔助蛋白酶的作用下，與CYP3A4基因啟動子上特定位點結合，發揮轉錄調控作用，引發一系列的生物學效應[11]。

本實驗采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR）和Western blot法，研究黃山毛峰茶多酚對小鼠肝Cyp3a11、PXR的影響，并采用雙熒光素酶報告基因技術闡明茶多酚調控CYP3A4的作用機制，以期揭示“藥茶不能同食”的理論依據，為臨床合理用藥、保障用藥安全性和有效性提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6小鼠（雌性SPF級，7～8 周齡，體質量（17±2）g，許可證號：SCXK（粵）2011-0015）和飼料均購自南方醫科大學實驗動物中心。

人肝癌HepG2細胞株購自中國科學院上海細胞庫。pSG5-hPXR表達質粒為美國德州大學西南醫學中心Steven Kliewer教授惠贈；pGL3-CYP3A4-XREM報告質粒為美國堪薩斯大學Jeff Staudinger教授惠贈；pRL-TK內參質粒、pSG5空載體、大腸桿菌DH5α菌株購自北京天恩澤基因科技有限公司。

黃山毛峰購于安徽黃山，屬二級茶葉，經烘干、打粉，過80 目篩，避光4 ℃保存。

UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒、1×TE buffer、Cyp3a11、PXR引物、Loading buffer 生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）、RNase-free水 日本Takara公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒 美國Pierce公司；脫脂奶粉 美國CST公司；NP-40 美國Merck公司；ECL化學發光液、預染蛋白Maker 美國Bio-Rad公司；胰蛋白胨、酵母提取物 英國Oxoid公司；氯化鈉、氨芐青霉素、甘油 美國Amresco公司；plasmid Midi Kit 德國QIAGEN公司；利福平（rifampicin，RIF）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基乙二胺、過硫酸銨、100×蛋白酶抑制劑、乙酸、乙腈、福林-酚試劑、沒食子酸（gallic acid，GA）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、兒茶素（catechin，C）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）美國Sigma公司；Cyp3a11、PXR一抗（多克隆兔抗）、二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔） 英國Abcam公司；DMEM basic（1×）、澳洲特級胎牛血清、Penicillin-Streptomycin雙抗、體積分數0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid，trypsin-EDTA）（1×）、Opti-MEM培養基 美國Gibco公司；Lipofectamine?3000 Transfection Kit 美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 美國Promega公司；沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、咖啡因（caffeine，CAF）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC） 北京盛世康晉化工研究院；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG） 廣州和為化工有限公司；表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、氯仿、無水乙醇等均為國產試劑。

1.2 儀器與設備

5180R型冷凍離心機、22331紫外分光光度計、微量移液槍、普通PCR儀 德國Eppendorf公司；FastPrep-24樣品處理系統 安倍醫療器械貿易（上海）有限公司；ABI Q6 Flex全功能定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司；MiniProtein電泳系統、MiniTrans-Blot轉膜系統、全自動凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；SpectraMax M5e多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；Laborota4001型旋轉蒸發儀 德國Hedolphg公司；MS1 Minishaker漩渦混合儀 德國IKA公司；DMIRB倒置生物熒光顯微鏡 德國Leica公司；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀日本島津公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚提取物含量及組分分析1.3.1.1 黃山毛峰茶多酚的提取

參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[12]并稍作修改：取20 g已處理的黃山毛峰茶粉，按1∶25（m/V）加入預熱的體積分數70%甲醇溶液，70 ℃水浴中冷凝回流冷浸提30 min，重復浸提3 次，合并濾液，將濾液旋轉蒸發至原體積的15%～20%，保證甲醇幾乎被完全蒸發，再用3 倍體積氯仿萃取1 次，再次旋轉蒸發，旋至萃取后體積的5%左右，溶解剩余部分于超純水中。15 000 r/min離心20 min，取上清液，真空冷凍干燥，常溫避光保存。

1.3.1.2 茶多酚提取物總多酚含量測定

總多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[13]。茶多酚含量以每克茶多酚提取物中所含的沒食子酸當量（mg GAE/g md）表示。每個樣品做3 組平行。

1.3.1.3 HPLC法分析茶多酚組成

樣品儲備液制備：準確稱取黃山毛峰茶多酚提取物10 mg，用體積分數50%甲醇溶液溶解，定容至10 mL，經0.45 μm有機膜過濾，于－80 ℃冰箱貯藏備用。

標準品溶液制備：準確稱取標準品GA、CAF、EGCG、EC、EGC、ECG、C、GC、CG、GCG 5 mg，分別用體積分數50%甲醇溶液定容至5 mL，于－80 ℃冰箱貯藏備用。使用前，根據實驗需要將各標準品貯備液用體積分數50%的甲醇溶液等梯度稀釋成適合濃度，配制成標準工作液以及混合標準溶液。進樣前經0.45 μm有機濾膜過濾。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為體積分數0.17%乙酸溶液；流動相B為體積分數100%乙腈；檢測波長280 nm；流速1 mL/min；進樣量10 μL；柱溫35 ℃。HPLC梯度洗脫程序參考李艷等[14]的方法（表1）。

表1 高效液相色譜洗脫條件Table1 Elution conditions for HPLC

1.3.2 茶多酚提取物對肝藥酶Cyp3a11的調控作用

1.3.2.1 動物實驗設計

將24 只健康成年SPF級C57BL/6小鼠隨機分為4 組，即空白對照組，黃山毛峰茶多酚提取物低（75 mg/（kg·d），以體質量計，下同）、中（150 mg/（kg·d））、高劑量（300 mg/（kg·d））組。動物在相對濕度50%～60%、溫度20～25 ℃、光照/黑暗分別為12 h的SPF級屏障環境內飼養。每天早上分別對實驗組小鼠灌胃不同劑量黃山毛峰茶多酚提取物，持續7 d，空白對照組按體質量（10 mL/kg）灌胃超純水7 d，灌胃2 h后正常進食、飲水。第7天灌胃2 h后斷頸處死，取肝組織，－80 ℃保存。

1.3.2.2 RNA的提取及real-time RT-PCR實驗

取凍存的小鼠肝臟50 mg，按照UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒和PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒提取及逆轉錄RNA。紫外分光光度計測定RNA純度。采用SYBR?Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）試劑盒對mRNA的表達進行相對定量，所有操作均在冰上進行；選擇β-actin作為內參基因，定量方法采用比較閾值法（2－△△Ct法），計算實驗組和空白對照組之間的基因表達水平的差異[15]。引物序列參照文獻[16]設計（表2）。

表2 Real-time RT-PCR引物Table2 Real-time RT-PCR primers used in this study

1.3.2.3 蛋白提取及Western blot實驗

用蛋白裂解液（每1 mL加10 μL 100 mmol/L的PMSF）提取肝臟蛋白，用BCA法定量蛋白質量濃度，取所需體積的蛋白質溶液按比例加入5×Loading buffer，100 ℃沸水浴煮5 min。樣品經過電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜，加入ECL發光液反應5 min后，采用化學發光成像系統進行自動曝光，并用Image Lab 5.1軟件系統對各顯色條帶進行半定量分析。

1.3.2.4 質粒瞬時轉染與雙熒光素酶報告基因檢測

對數生長期HepG2細胞按1×104個/孔接種到96 孔板中，培養24 h。將質粒pSG5-hPXR或pSG5、pRL-TK、CYP3A4-XREM-Luc、脂質體與Opti-MEM培養基孵育20 min。移去96 孔中原有培養基，每孔加入50 μL無雙抗的DMEM培養基（含體積分數10%胎牛血清）。完成孵育后，向每孔中加入50 μL上述脂質體-DNA混合物。培養24 h后，加入含有不同質量濃度黃山毛峰茶多酚提取物（茶多酚低、中、高質量濃度組分別為100、200、300 μg/mL）的無血清培養基，同時設置10 μmol/L RIF作為陽性對照組，體積分數0.1% DMSO作為溶劑對照組。給藥24 h后，移去培養基，并用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞1 次，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明進行雙熒光酶活力檢測。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 茶多酚提取物含量及組分分析

根據沒食子酸濃度與吸光度得標準曲線：y＝0.002 4x+0.032 3（R2＝0.998 8），式中y表示吸光度，x表示沒食子酸質量濃度，由該回歸方程計算得出黃山毛峰茶多酚提取物中總多酚含量為（434.11±8.76）mg GAE/g md。HPLC結果表明黃山毛峰茶多酚提取物中含EGCG（265.57 μg/mg，占總物質的26.6%）、ECG（133.05 μg/mg）、C（69.27 μg/mg）、EGC（64.92 μg/mg）、CAF（37.85 μg/mg）、EC等物質（圖1、表3）。

圖1 茶多酚混合標準品（A）、黃山毛峰茶多酚提取物（B）在280 nm波長處的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standards of tea polyphenols (A) and tea polyphenols from Huangshan Maofeng tea (B)

表3 HPLC定量分析黃山毛峰茶多酚Table3 HPLC quantitative analysis of tea polyphenols in Huangshan Maofeng tea

2.2 黃山毛峰茶多酚提取物對Cyp3a11表達水平的影響

圖2 黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝Cyp3a11 mRNA表達的作用Fig.2 Effect of tea polyphenols from Huangshan Maofeng tea on mRNA expression of Cyp3a11 in liver of mice

如圖2所示，與空白對照組相比，黃山毛峰茶多酚提取物各劑量組對小鼠肝Cyp3a11 mRNA的表達呈顯著誘導作用（P＜0.01），無明顯的量效關系。

圖3 黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝Cyp3a11蛋白表達的作用Fig.3 Effect of tea polyphenols from Huangshan Maofeng tea on protein expression of Cyp3a11 in liver of mice

如圖3所示，與空白對照組相比，黃山毛峰茶多酚提取物各劑量組均對小鼠肝Cyp3a11蛋白的表達有顯著誘導作用（P＜0.01），隨劑量的升高誘導作用逐漸減弱，呈一定的量效關系。

由圖2、3可以看出，在黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝Cyp3a11的影響作用中，其mRNA和蛋白表達的分析結果趨勢不大相同，但總體說來，各劑量組對小鼠肝Cyp3a11 mRNA及其蛋白的表達均呈顯著誘導作用，mRNA表達結果與蛋白表達結果一致，說明黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝Cyp3a11呈顯著誘導作用。

2.3 黃山毛峰茶多酚提取物對PXR表達水平的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，黃山毛峰茶多酚提取物各劑量組均對小鼠肝PXR mRNA的表達呈顯著誘導作用（P＜0.01），隨劑量的增高誘導作用逐漸減弱，存在明顯的量效關系。

圖4 黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝PXR mRNA表達的作用Fig.4 Effect of tea polyphenols from Huangshan Maofeng tea on mRNA expression of PXR in liver of mice

圖5 黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝PXR蛋白表達的作用Fig.5 Effect of tea polyphenols from Huangshan Maofeng tea on protein expression of PXR in liver of mice

如圖5所示，與空白對照組相比，黃山毛峰茶多酚提取物各劑量組均對小鼠肝PXR蛋白的表達有極顯著誘導作用（P＜0.01），無明顯的量效關系。

由圖4、5可以看出，在黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝PXR的影響作用中，其mRNA和蛋白表達的分析結果趨勢不大相同，但總體說來，黃山毛峰茶多酚提取物各劑量組對小鼠肝PXR mRNA及其蛋白的表達均呈顯著誘導作用，mRNA表達結果與蛋白表達結果一致，說明黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝PXR呈顯著誘導作用。

2.4 黃山毛峰茶多酚提取物對PXR-CYP3A4雙熒光素酶報告基因的影響

與溶劑對照組比較，陽性對照組CYP3A4熒光素酶活力極顯著增強（P＜0.01），是溶劑對照組的6.11 倍，表明高靈敏度的PXR-CYP3A4熒光素酶報告基因體系成功建立（圖6）；隨著黃山毛峰茶多酚提取物質量濃度的升高，CYP3A4螢光素酶活力逐漸增強（P＜0.01），100、200、300 μg/mL黃山毛峰茶多酚提取物劑量組分別是溶劑對照組的（3.86±0.05）、（4.82±0.72）、（5.38±0.11）倍，呈現一定的劑量依賴性，提示黃山毛峰茶多酚物提取物可能作為PXR的配體從而激活CYP3A4 DNA反應元件，上調CYP3A4的表達。與陽性對照組比較，黃山毛峰茶多酚提取物低、中、高各質量濃度+RIF組CYP3A4熒光素酶活力均有不同程度增強，其中，中質量濃度+RIF組CYP3A4熒光素酶活力極顯著增強（P＜0.01），說明黃山毛峰茶多酚提取物與RIF能夠協同作用于PXR通路誘導CYP3A4活性。

圖6 黃山毛峰茶多酚提取物經PXR通路對CYP3A4熒光素酶活性的影響Fig.6 Effect of tea polyphenols from Huangshan Maofeng tea on CYP3A4 luciferase activity through the PXR pathway

3 討 論

茶多酚主要經由CYP450酶代謝，其中CYP3A作為P450家族中最重要的I相藥物代謝酶系統參與多種內源性及外源性物質在體內轉化[17]。而通過它進行代謝作用的物質本身亦會對它產生作用，其誘導或抑制將產生復雜的藥物和其他藥物或化合物之間的相互作用，這種相互作用可能會引起藥物在體內的潛在毒性[18-19]。國內外大量研究表明，內、外源性物質對于CYP3A酶活性的抑制或誘導作用往往是源于其作為配體激活了多種NRs，其中PXR是CYP3A4的關鍵轉錄調控因子[20-21]。目前國內外研究主要集中在茶多酚提取物一些生物活性上，如對抗氧化、抗腫瘤、抑菌等，而茶多酚對肝藥酶的影響作用研究甚少[22]。本實驗從基因轉錄水平和蛋白表達水平上對黃山毛峰茶多酚提取物對小鼠肝Cyp3a11的作用進行了探討，并采用雙熒光素酶報告基因檢測技術來觀察黃山毛峰茶多酚提取物是否為PXR的外源性配體，從基因調控角度闡明茶多酚影響Cyp3a11的作用機制。

PXR報告基因依據PXR調節CYP3A4表達而建立，通過此實驗模型可了解外源化學物對CYP3A4的誘導情況及對CYP3A4的誘導是否通過PXR這一途徑起作用。PXR活化在報告基因實驗和人肝細胞實驗中有很好的相關性，實驗系統不存在個體差異，重現性好。本研究采用了目前報告基因應用最為廣泛的HepG2細胞模型，該細胞中的PXR表達量低，內源性干擾少，故外源性的PXR可以實現高表達。為了提高實驗系統的靈敏度，優化質粒轉染體系，基于本實驗室各方面的條件及其他成員的研究，最終選擇每孔轉染的質粒質量分別為：100 ng pSG5-hPXR、100 ng pGL3-CYP3A4-XREM以及6 ng pRL-TK。

本研究結果表明：1）黃山毛峰茶多酚提取物中總多酚含量為（434.11±8.76）mg GAE/g md，主要含有EGCG、ECG、C、EGC這4 種物質，含量高達532.81 μg/mg，占總物質的53.3%。此外，在HPLC圖中存在其他高響應峰，可推斷黃山毛峰茶多酚提取物中還含有其他含量較高的酚類物質及衍生物，需要進一步確認這些高含量物質，以便更全面分析黃山毛峰茶多酚提取物中主要酚類組分成分及含量對肝藥酶的調控作用。2）黃山毛峰茶多酚提取物各劑量組對小鼠肝Cyp3a11及核受體PXR的mRNA和蛋白表達均呈顯著誘導作用，說明黃山毛峰茶多酚提取物能誘導小鼠肝Cyp3a11表達各劑量組可能機制為通過對調控PXR實現。PXR是一種配體依賴性轉錄因子，底物廣泛，配體上官能團電子性質對PXR調節方向至關重要，決定其是PXR抑制劑或激活劑[23-24]。3）報告基因檢測結果進一步驗證上述判斷，黃山毛峰茶多酚提取物可通過激活PXR通路來上調CYP3A4表達。Rhodes等[25]在CYP3A4啟動子區發現并鑒定了反向重復序列（everted repeat，ER）-6、遠端外源物反應增強子模體、直接重復序列（directed repeat，DR）-3等PXR的反應元件。此外，結合人源化轉基因小鼠模型可知，CYP3A4誘導表達的種屬特征完全由PXR受體決定[26]。4）PXR-CYP3A途徑不是一個封閉式的反應模式，CYP3A4調控區可以和多種核受體結合從而促進或抑制基因的表達，且它們對CYP3A4轉錄調控作用方式及調節轉錄過程之間的關聯有待進一步研究。Burk等[27]研究表明PXR和組成型雄甾烷受體（constitutiveandrostane receptor，CAR）能以交互方式的方式共同調節CYP3A轉錄活化，顯示核受體對P450酶的調控方式可能具有網絡性。Keisuke[28]等曾報道肝X受體α（liver X receptor α，LXRα）在CYP3A4的表達中的獨特雙重作用：作為CYP3A4正調節因子，LXRα可通過dNR1和eNR3A4反應元件上調CYP3A4表達，但卻抑制PXR介導CYP3A4表達。此外，影響CYP3A4表達的因素很多，如一些影響核受體與CYP3A4結合的因素[29]、物質與酶的直接結合產生的競爭性抑制效應或變構效應等[30-31]。

綜上所述，黃山毛峰多酚物提取物通過PXR通路來誘導Cyp3a11表達，從而影響其他藥物或化學物在人體的代謝，甚至有可能發生與合用藥物之間的相互作用。要全面闡述酶的抑制或誘導機制，這些方面仍需繼續深入研究，如黃山毛峰多酚物提取物對Cyp3a11表達的影響是否與其他核受體如CAR、LXRα有關，它們與配體之間的結合能力和結合順序是否有差異，當介導Cyp3a11表達時它們之間的關系又如何。此外，還需要結合黃山毛峰多酚物提取物對其他CYP450亞型和其他藥物代謝酶（如酯酶、葡萄糖醛酸基轉移酶及藥物轉運體（如P-糖蛋白）的相關作用及它們之間的聯系才能準確預測黃山毛峰多酚物提取物對其他藥物或化學物代謝行為的影響。