β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長、血清生化及免疫指標的影響

鄭 鑫， 殷海成*，李昕碩，黃 進，黃 巍

（河南工業大學生物工程學院，河南鄭州450001）

豆粕不僅蛋白質含量高，而且資源豐富、價格合理，常作為水產養殖動物飼料中替代魚粉的蛋白源（Lin 等，2011；Elangovan 等，2000）。 然而，豆粕含有胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白等多種抗營養因子，不僅妨礙水產養殖動物對飼料營養成分的消化與吸收，而且高比例添加會造成魚的腸道過敏型損傷（Ringo等，2006）。其中，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是豆粕中主要的抗原蛋白，尤其是 β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）具有比大豆球蛋白更強的免疫原性（Ogawa等，1995），常誘導幼齡動物如稚魚、幼魚等腸道發生變態反應，引起機體免疫功能紊亂，造成腸道損傷（Zhang等，2013）。吳莉芳等（2008）通過對草魚、鯉魚和埃及胡子鲇幼魚飼喂含大豆抗原蛋白飼料，發現大豆抗原蛋白會破壞三種食性不同魚的腸道組織完整性，使腸絨毛脫落和腸上皮細胞分離，影響其生長和飼料利用率。同樣，Zhang等（2013）證實了β-伴大豆球蛋白會導致幼建鯉腸道和腸上皮細胞氧化應激和過敏損傷。此外，血液系統作為魚體免疫防御的第二道防線，可反映其屬性和生理狀態，與其代謝、營養與健康等密切相關（向梟等，2012）。關于大豆球蛋白對鯉幼魚血液主要生化指標的影響已有報道（賴紅娥等，2013）。但對于β-伴大豆球蛋白對“豫選黃河鯉”幼魚血液生化指標的影響鮮見報道。本試驗以“豫選黃河鯉”幼魚（幼鯉）為研究對象，通過飼喂添加不同比例的β-伴大豆球蛋白全價飼料，探討其對幼鯉生長、血清生化和免疫指標的影響，為合理利用豆粕/大豆蛋白源及解析β-伴大豆球蛋白的抗營養機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 飼料制備 以魚粉和β-伴大豆球蛋白為蛋白源，魚油和豆油為脂肪源，α-淀粉和糊精為糖源，并補充賴氨酸、蛋氨酸以及復合維生素和礦物質配制含 β-伴大豆球蛋白為 0、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和 12.5%的 6組等氮 （粗蛋白質38.0%）等能（總能15.0 MJ/kg）的試驗飼料。各原料組分經粉碎過篩（60目），按配方標準稱重，加油、加水充分混合，用曲阜市圣魯機械廠生產的SLKL-120B型制粒機加工成1.0 mm直徑的顆粒飼料，于40℃下烘干6 h，4℃冰箱中保存備用。試驗飼料組成及營養成分見表1。

1.2 試驗魚與養殖管理 試驗用幼鯉為河南省水科院種魚繁殖場繁育的第8代“豫選黃河鯉”幼魚，經河南工大生物工程學院魚類營養實驗室內馴化2周 （馴化期用魚粉配制的全價飼料進行飼喂）后，選取體重為（48.37±0.03）g 幼鯉 540 尾，隨機分成6組，每組3個重復，每個重復30尾，分養于18個安有自動循環水的水族箱中，用表1飼料進行8周的養殖試驗。每天2次 （9:00和17:00），按照體重的1.3%和1.7%投喂。試驗用水為曝氣的自來水，水溫為（25±1）℃，溶氧和pH約為6.0 mg/L和 6.8。

1.3 樣品采集與測定指標 8周養殖試驗結束，對各組幼鯉禁食 24 h，用MS-222（0.03%）麻醉，稱重和測體長（L），計算各組平均增重率（WGR）、飼料系數（FCR）、蛋白質效率（PER）和平均肥滿度（CF）。各重復組隨機選取幼鯉10尾，心臟取血。血液在4℃條件下，以3000 r/min離心25 min，分離血清，-20℃冰箱保存備用，用于測定血清生化及免疫指標。

1.3.1 血清生化指標檢測 血清生化指標采用鄭州大學一附院Cobas-Mira全自動生化分析儀（羅氏公司，瑞士）檢測。其中，雙縮脲法檢測總蛋白（TP）量、溴甲酚綠法測白蛋白（ALB）量、速率法檢測谷丙（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活性、酶法檢測甘油三酯（TG）和膽固醇（CHOL）量。其中，血清總蛋白（540 nm）或白蛋白（630 nm）/（g/L）＝測定管吸光度/標準管吸光度×蛋白標準液濃度（g/L）；谷丙（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活性/（U/L）=△A/min×F （其中，△A/min為時間變化率，F 試劑因數）； 膽固醇濃度/（mmol/L）=ESA/EST×5.17（ESA、EST為620 nm處血清和標準液光密度）。

表1 飼料組成及營養水平（風干基礎）

1.3.2 血清免疫指標檢測 采用免疫試劑盒檢測血清（南京建成生物工程研究所）溶菌酶含量、免疫球蛋白 M（IgM）、白介素 1α（IL-1α）、補體C3、堿性磷酸酶（AKP），具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。其中，速率散射比濁法檢測血清補體C3量。運用補體C3抗原與C3抗體反應生成免疫復合物，免疫復合物有一定的濁度，其濁度與補體C3的量成正比，通過與同樣方法處理校準液比較，可知血清補體C3含量。同樣方法檢測血清IgM和IL-1α含量。比色法檢測堿性磷酸酶（AKP，U/mg）活性，1 個堿性磷酸酶活性單位定義為100 mL血清在37℃與底物作用15 min產生1 mg酚（Pipe等，1990）。溶菌酶活性測定參照Ellis（1990）的方法。一個溶菌酶活性單位定義為單位時間（min）內每毫克蛋白質使吸光值變化0.001 的酶量 （U/mg）。

1.4 數據處理

WGR/%=（Wt-W0）/W0×100；

FCR=飼料投喂量/Wt-W0；PER/%=（Wt-W0）/（飼料投喂量 × 飼料蛋白含量）×100；CF/（g/cm3）=Wt/L3×100。

式中：Wt、W0分別為試驗末期和初期幼鯉的平均體質量，g；L 為體長，cm。

試驗數據用“平均數±標準差”表示，數據用軟件SPSS 17.0進行單因素方差分析 （One-way ANOVA），若組間差異顯著再進行Duncan’s多重比較，差異水平用p＜0.05表示。

2 結果

2.1 β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長和飼料效率的影響 由表2可知，隨β-伴大豆球蛋白添加量增加，各組幼鯉的終末體重、增重率、蛋白質效率和肥滿度顯著降低，飼料系數顯著增加 （p＜0.05）。其中，2.5%的β-伴大豆球蛋白組的上述指標與對照組差異不顯著（P＞0.05）；當β-伴大豆球蛋白添加量等于5.0%時，幼鯉增重率和蛋白質效率對比對照組分別降低14.67%、13.09%，而飼料系數比對照組顯著升高14.49%（p＜0.05）；12.5%β-伴大豆球蛋白組肥滿度顯著低于對照組7.93%（p＜0.05）。

表2 β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長和飼料效率的影響

2.2 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清生化指標的影響 由表3可知，隨β-伴大豆球蛋白添加量增加，幼鯉血清血糖先增后降，而甘油三酯、尿素氮、膽固醇、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性呈現升高的趨勢，總蛋白呈現降低的趨勢 （p＜0.05）。其中，β-伴大豆球蛋白添加量為5.0%和7.5%兩組血糖顯著高于對照組27.89%、23.22%（p＜0.05），添加量為12.5%組的甘油三酯、尿素氮和膽固醇分別顯著高于對照組27.36%、29.51%、9.05%（p＜ 0.05）， 添加量為 10.0%和12.5%組的谷丙轉氨酶分別顯著高于對照組9.61%、14.98%，谷草轉氨酶活性分別顯著高于對照組 8.12%、10.05%（p＜ 0.05），添加量為10.0%和12.5%組的總蛋白分別顯著低于對照組12.22%、13.52%（P ＜ 0.05）。當 β-伴大豆球蛋白添加量為5.0%、7.5%和12.5%時，幼鯉血清白蛋白分別顯著低于對照組16.35%、11.66%、10.98%（p＜0.05），而添加量為2.5%和10.0%時血清白蛋白與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清生化指標的影響

2.3 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清免疫指標的影響 由表4可知，隨β-伴大豆球蛋白添加劑量增5.0%兩組血清溶菌酶活性與對照組差異不顯著（P＞0.05），添加量超過5.0%時則顯著高于對照組（p＜0.05），以添加7.5%組最高，為24.11%。血清補體C3變化與溶菌酶活性相似，其中添加5.0%和7.5%組分別顯著高于對照組20.84%、14.08%（p＜0.05），添加2.5%和10.0%組與對照組差異不顯著（P＞0.05），但添加12.5%組顯著低于對照組1.59%（p＜0.05）。對比對照組，血清免疫球蛋白和白介素-1α隨β-伴大豆球蛋白添加量顯著增加（p＜0.05），但添加2.5%組的免疫球蛋白、添加2.5%～5.0%組的白介素-1α與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。血清堿性磷酸酶活性在β-伴大豆球蛋白添加量為5.0%時比對照組顯著升高40.48%，而添加量為7.5%和10%時又分別顯著升高37.73%、27.30%（p＜0.05）， 其中添加 2.5%和12.5%組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表4 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清免疫指標的影響

3 討論

3.1 β-伴大豆球蛋白對幼鯉生長和飼料效率的影響 大豆抗原蛋白一方面不僅可干擾人和動物腸道對營養成分的消化和吸收、引起機體新陳代謝紊亂和造成生理生化反應障礙，另一方面由于幼齡動物免疫系統發育不完善，因而常常造成幼齡動物過敏而導致經濟損失。其中，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白是大豆抗原蛋白的主要組分，尤其是免疫原性極強的β-伴大豆球蛋白常常誘導幼齡動物過敏反應 （Ostaszewska等，2005）。Zhao等（2010）研究證實4%的β-伴大豆球蛋白對仔豬十二指腸腸上皮細胞形態結構、增殖與凋亡產生影響，使腸上皮細胞形態結構發生改變、凋亡增加。Zhang等（2013）通過體內外試驗研究β-伴大豆球蛋白誘導幼建鯉腸道上皮細胞，結果也證實β-伴大豆球蛋白可引起幼建鯉腸道炎癥和腸上皮細胞氧化損傷，導致其腸道對營養物質消化吸收功能障礙并降低其生長性能。除此之外，魚類攝入高劑量β-伴大豆球蛋白能夠引起消化酶活性降低，導致魚的消化機能下降，從而降低魚的生長性能和對飼料營養物質的利用。孫玲（2008）報道，不同食性魚類攝食大豆抗原蛋白可使消化酶活性降低。本研究中，添加5.0%的β-伴大豆球蛋白，其增重率、蛋白質效率顯著降低，而飼料系數顯著增加（p＜0.05）。這可能是幼鯉消化道發育不全，消化酶分泌不足，使β-伴大豆球蛋白滯留消化道，造成應激反應，誘導幼鯉魚黏膜過敏性損傷。吳莉芳等（2011）利用60.0 mg/g的大豆球蛋白和40.0 mg/g的β-伴大豆球蛋白連續飼喂鯉、埃及胡子鲇和草魚6周，結果發現，三種魚的腸道完整性呈現不同程度的損傷，生長性能下降。同樣，Rumsey等（1994）利用 34.4 mg/g的 β-伴大豆球蛋白使虹鱒腸道的完整性破壞和生長能力下降。

3.2 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清生化指標的影響 血液生化指標與其代謝密切相關，常用于反映動物的健康與生理狀況。谷草/谷丙轉氨酶是動物肝細胞合成的兩種重要轉氨酶，可參與調節動物機體蛋白質合成與代謝，而尿素氮是蛋白質代謝產生的主要終末產物之一，正常生理條件下，血清谷草/谷丙轉氨酶和尿素氮的含量較低。研究證實，肝細胞受到應激或受損，會導致轉氨酶從肝細胞進入血液，使血清中的含量升高，因此，其含量是反映肝細胞損傷的重要標志 （Strange等，1977）；而尿素氮在血清中的含量較低，表明蛋白質合成增強。在本試驗中，添加小于等于7.5%β-伴大豆球蛋白的各組幼鯉血清谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性與對照組差異不顯著（P＞0.05），但略有升高，表明適量β-伴大豆球蛋白對幼鯉肝臟未造成顯著損傷，而添加10.0%和12.5%時，谷草和谷丙轉氨酶顯著升高，表示肝細胞膜通透性增加；添加小于等于10.0%β-伴大豆球蛋白各組，幼鯉甘油三酯、尿素氮和膽固醇與對照組差異不顯著（P＞0.05），但略有增加，提示幼鯉肝細胞蛋白合成能力未受到嚴重影響，而添加12.5%時顯著增加（p＜0.05），表明肝細胞受損。因為魚血清中70%～80%膽固醇源于肝細胞，一旦肝細胞損傷，則血清膽固醇含量升高；甘油三酯含量高低可反映動物機體脂肪代謝水平，血清甘油三酯含量的增加，預示肝損傷，這一結果與Ma等（2005）結果類似。血清蛋白對于維持細胞營養、血液膠體滲透壓和機體免疫功能起重要作用，可反映出肝細胞合成蛋白的能力 （Kaushik等，2004）。血糖作為機體的能量供給物質，其含量高低易受機體新陳代謝和環境因子的影響，生理條件下，血糖升高，則魚的活動增強、攝食增加（Imsland等，2001）。本試驗條件下，添加β-伴大豆球蛋白小于等于7.5%時，幼鯉血清中總蛋白與對照組無顯著差異，而添加5.0%和7.5%β-伴大豆球蛋白兩組幼鯉血糖含量顯著高于對照組，相反白蛋白顯著低于對照組（p＜0.05），表明幼鯉為滿足蛋白合成，能量供求增加，相應地使機體免疫力降低。

3.3 β-伴大豆球蛋白對幼鯉血清免疫指標的影響 魚類和其他脊椎動物一樣，其血清中含有多種非特異性和特異性免疫因子，如溶菌酶、堿性磷酸酶、白介素、補體C3和免疫球蛋白等，檢測血清不同免疫指標能體現其機體免疫應答水平（Keller等，1990）。溶菌酶作為其非特異性免疫因子之一，其活力的變化可反映非特異性免疫防御狀態。本試驗中，2.5%和5.0%β-伴大豆球蛋白添加量對幼鯉血清溶菌酶活力影響不顯著，當添加7.5%及更高的β-伴大豆球蛋白，血清溶菌酶活力顯著升高（p＜0.05），說明β-伴大豆球蛋白可激活幼鯉血清非特異性免疫應答。Kogdahl等（2000）用含豆粕的日糧飼喂大西洋鮭3周后發現，中、后腸溶菌酶活力顯著高于對照組，說明大豆蛋白源能激活魚類的非特異性免疫系統。堿性磷酸酶是與骨細胞代謝密切相關的代謝調控酶，其可參與磷酸基團、鈣和磷的代謝等活動，因此，在營養物質的吸收與利用中發揮作用。研究證實堿性磷酸酶活力的升高是肝病發生的信號源之一（Giannini等，2005）。 本試驗中，添加5.0%～10.0%的β-伴大豆球蛋白，幼鯉血清堿性磷酸酶顯著高于對照組，說明幼鯉代謝活性增強，同時也預示肝細胞膜通透性增加或損傷。然而，Tibaldia等（2006）利用25%的豆粕替代飼料中18.67%的魚粉研究歐洲鱸魚發現腸道堿性磷酸酶活力降低了16.27%。關于大豆蛋白可引起幼鯉血清堿性磷酸酶變化差異還需進一步研究。巨噬細胞能分泌白介素、補體C3等多種免疫因子參與機體免疫。張錦秀等（2008）研究分離大豆蛋白對幼建鯉腸道健康的影響發現，幼建鯉的前、后腸出現頂端細胞脫落、固有層增厚且白細胞增加等病理癥狀，激活腸道特異性和非特異性免疫應答。鄒文超等（2014）在斜帶石斑魚飼料中用豆粕替代魚粉觀察其血清溶菌酶、補體C3和IgM水平發現各替代組均高于對照組。本試驗中，添加大于等于5.0%β-伴大豆球蛋白組幼鯉血清免疫球蛋白M、添加大于等于7.5%組白介素-1α和添加5.0%、7.5%組的血清補體C3均顯著高于對照組，提示添加5.0%及更多的β-伴大豆球蛋白能激活幼鯉免疫系統，增加促炎性細胞因子水平。然而，研究發現高劑量添加大豆蛋白在魚類飼料中，能抑制魚的非特異性免疫。Burrells等（1999）用低于50%的豆粕飼料飼喂虹鱒，發現對免疫狀態沒有顯著影響，但用含70%的去皮豆粕飼料時，則明顯出現抑制，這一結果與張錦秀等（2007）研究高劑量添加去皮大豆飼喂幼建鯉相似。由于目前關于大豆蛋白對魚的免疫報道很少，其差異的原因有待進一步試驗驗證。

4 結論

飼料中添加2.5%的β-伴大豆球蛋白不影響幼鯉生長、血清生化和免疫指標，添加5.0%或更高劑量則降低其生長性能，影響白蛋白、免疫球蛋白M、補體C3和堿性磷酸酶等血清生化指標，故幼鯉飼料中以添加2.5%的β-伴大豆球蛋白為宜。