miR-34c在口腔鱗狀細胞癌的表達及對Tca8113細胞生物學行為的影響

常 凱，高繼萍，宋曉娜，續國強，衛佳寧，田曉琳，宋國華*

(1.山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001； 2.晉中學院生物科學與技術學院，山西 晉中 030600)

口腔癌是常見的惡性腫瘤，在全球常見癌癥中居第6位，其中90%屬口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，口腔癌發病率高且預后生存率低。microRNA(miRNA)的異常表達與口腔癌的發生、轉移和預后密切相關[1]。miR-34是一類在進化上非常保守的miRNA，miR-34家族(miR-34s)包括三個同源基因：miR-34a、miR-34b及miR-34c。研究發現：miR-34c參與肺癌、結直腸癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌等常見癌癥的發生，主要通過促進腫瘤細胞凋亡；抑制腫瘤細胞增殖與分化；抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移等生物學效應發揮抑制腫瘤的作用。但是并沒有關于miR-34c在口腔癌的功能的報道，我們課題組進行miRNA測序，結果發現miR-34c在口腔黏膜癌組織特異性表達，提示我們miR-34c對于口腔黏膜癌的臨床價值，為進一步明確miR-34c在口腔癌中的作用，我們利用脂質體轉染調節miR-34c在口腔癌中的表達，探討miR-34c對口腔癌細胞生物學行為的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

實驗選用清潔級雄性8～10周齡的中國地鼠60只，體重25～35 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供[SCXK (晉) 2015-0001]。屏障環境[SYXK (晉) 2015-0001]中飼養，溫度為25℃左右，相對濕度40%～70%。動物實驗嚴格按照山西醫科大學實驗動物管理委員會制定的操作規程(IACUC號：2015011)，符合3R原則。

1.1.2 細胞株

體外實驗選用人舌鱗癌細胞株Tca8113購自Boster(博士德)。

1.2 主要試劑與儀器

TriPure Isolation Reagent試劑購于Roche;All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit,All-in-OneTMqPCR Mix和All-in-OneTMqPCR Primer均購于GeneCopoeia;脂質體RNAiMAX試劑購于Invitrogen;Opti-MEM培養基購于Gibco;miRNA-34c mimics和miRNA-34c inhibitor均由Gene Pharma合成；Express miRNA Extraction試劑盒，HG Taq Man miRNA cDNA Synthesis試劑盒和HG Taq Man miRNA qPCR試劑盒均購自Hai Gene;RPMI 1640培養基購自Hyclone;胰酶、胎牛血清和Cell-Counting Kit-8試劑盒購自Boster;100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素購自Solarbio。普通PCR儀(美國Bio-Rad公司);Step one plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司);酶標儀(美國Bio-Rad公司);CO2細胞培養箱(Sanyo公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織miR-34c表達水平的檢測

0.5% DMBA丙酮液涂擦中國地鼠雙側頰囊制備口腔黏膜癌模型。本實驗選取中國地鼠口腔癌組織和正常組織(保存于-80℃冰箱)進行qPCR驗證實驗。用TriPure提取中國地鼠口腔癌和正常組織總RNA(各取3只中國地鼠)，用分光光度計測定RNA濃度和純度，A260/A280均在2.0左右。然后按照miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，以大鼠5s RNA作參照進行相對定量分析，根據All-in-OneTMqPCR Mix說明書進行。qRT-PCR采用3步法：Stage 1(預變性)：95℃，10 min，1個循環；Stage 2(PCR反應)95℃，10 s，60℃，20 s，然后72℃，10 s，40個循環；Stage 3(溶解曲線分析)72℃～95℃，溫度間隔0.5℃，10 s/each。結果以2-ΔΔCt法表示miRNA-34c的相對表達量。

1.3.2 細胞的培養

Tca8113于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基，37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.3.3 細胞的轉染

將細胞接種于培養板，待細胞融和度達到60%～80%按照Lipofectamine RNAiMAX Reagent說明書進行脂質體轉染，實驗分為miR-34c模擬物組(miR-34c mimics，終濃度為50 nmol/L)、miR-34c抑制物組(miR-34c inhibitor，終濃度為50 nmol/L)和空白對照組(control)。hsa-miR-34c mimics序列為：AAUCACUAACCACACGGCCAGG，UGGCCGUGUGG UUAGUGAUUU；hsa-miR-34c inhibitor序列為：CCUG GCCGUGGUUAGUGAUU。

1.3.4 細胞中miR-34c表達水平的檢測

按照Express miRNA Extraction試劑盒說明書提取轉染48 h處于生長對數期細胞的miRNA，使用酶標儀測定提取的濃度及純度(A260/A280)。按照HG Taq Man miRNA cDNA Synthesis試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，采用加A法進行反轉錄。qRT-PCR按照HG Taq Man miRNA qPCR試劑盒說明書配制反應體系(20 μL體系)。以RNU6B作為內參，采用2步法：Stage 1(Holding stage)95℃，10 s，1個循環；Stage 2(Cycling stage)95℃，10 s，然后60℃，60 s，40個循環。結果以2-ΔΔCt法表示miRNA-34c的相對表達量。

1.3.5 細胞增殖能力的檢測

按每孔1.0 × 103的密度將細胞接種于96孔培養板上，每孔加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液100 μL，待細胞貼壁融和度達到60%～80%后，加入轉染試劑，按照CCK-8試劑說明書，于加入轉染試劑之前和加入轉染試劑24 h、48 h、72 h后在酶標儀450 nm波長處檢測每孔吸光度(optical density，OD)值，以OD值反映細胞增殖情況。

1.3.6 細胞遷移能力的檢測

將生長狀態良好的細胞接種于六孔板，待細胞貼壁后加入轉染試劑，待細胞生長密度達到90%以上，用200 μL無菌槍頭在6孔板內以“1”字形劃痕，然后立即用PBS漂洗懸浮細胞，加入RPMI 1640培養基繼續培養，分別于劃痕后0 h、24 h、48 h和72 h在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞愈合情況，用Image Pro Plus 6.0處理圖片并記錄相對遷移距離。

1.4 統計學方法

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 miR-34c在口腔癌細胞中的表達Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 2 Expression of miR-34c in the Tca8113 cells

2 結果

2.1 口腔癌中miR-34c的表達

課題組在前期已成功構建中國地鼠口腔頰囊黏膜癌和鱗癌模型，并對口腔黏膜癌組織和正常組織進行高通量測序技術測序及生物信息分析，發現miR-34c在中國地鼠口腔黏膜癌組織中表達顯著上調，對其進行qPCR驗證，結果表明：與正常組織相比，口腔癌組織中miR-34c表達明顯升高，其表達量是正常組的11.95倍。結果見圖1所示。

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖1 口腔癌組織中miR-34c表達量Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 1 Expression of miR-34c in the oral squamous cell carcinoma tissues

2.2 miR-34c轉染效率的檢測

轉染miR-34c inhibitor后，miR-34c表達量是對照組的0.166倍，miR-34c表達量明顯下調，差異有顯著性(P< 0.01)。轉染miR-34c mimics后，miR-34c表達量是對照組的280.917倍，miR-34c表達量明顯上調，差異有顯著性(P< 0.01)。結果見圖2。

2.3 miR-34c對Tca8113細胞增殖能力的影響

72 h的CCK-8實驗結果顯示，與對照組相比，miR-34c mimics組的增殖能力顯著減弱(P<0.01)，miR-34c inhibitor組的增殖能力顯著增強(P<0.05)，說明上調miR-34c表達可抑制細胞增殖，降低細胞活力。結果見圖3。

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 調節miR-34c表達水平對Tca8113細胞活力的影響Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 3 Effect of miR-34c on the proliferation of tongue cancer cell line Tca8113 cells

2.4 miR-34c對Tca8113細胞遷移能力的影響

劃痕實驗顯示，隨著時間的推移，各組遷移距離都逐漸增加。與對照組72 h遷移擴張距離相比，miR-34c mimics組的遷移能力與對照組差異無顯著性，miR-34c inhibitor組的遷移能力顯著增強，說明下調miR-34c表達可促進細胞遷移。結果如表1和圖4所示。

表1 調節miR-34c表達水平對Tca8113細胞遷移的影響

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

多種miRNA在口腔癌中異常表達，其與口腔鱗狀細胞癌(OSCC)的發生、診斷及預后密切相關[2]。miRNA可作為癌基因或抑癌基因，對腫瘤的生物學行為有重要的調控作用[3 - 5]。miR-34a/375/195/26a/29b等miRNA可通過多種轉錄因子和靶基因來調控舌鱗癌細胞的增殖、周期、遷移、侵襲和凋亡，并與腫瘤大小、轉移、復發以及預后等臨床病理特點相關，為舌鱗癌患者的預后判斷以及手術和靶向治療方案提供了參考[6]。

本課題組前期利用高通量測序成功構建中國地鼠口腔癌組織和正常組織差異表達的miRNA表達譜，發現11個表達差異有顯著性的miRNA。我們挑選了與腫瘤密切相關的miR-34c，對其進行qPCR驗證，結果表明miR-34c在口腔癌組織中表達顯著上調[7]。人類miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c。在正常細胞中miR-34a發揮促進細胞衰老、使細胞周期阻滯在G1期和誘導細胞凋亡等作用[8]。miR-34a也參與乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、惡性膠質瘤、胰腺癌和肺癌等多種疾病的發生[9 - 10]，Jia等[11]的研究表明miR-34a靶向調控MMP-9和MMP-14，從而抑制舌鱗狀癌細胞的轉移和侵襲。miR-34a在TSCC淋巴結轉移患者的預后和基因治療中也具有潛在的應用價值。miR-34b和miR-34c也具有潛在的抑癌作用[12]。miR-34c在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸癌、腦膠質瘤、鼻咽癌、喉癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤中表達下調[13]。武震東[14]轉染miR-34c-3p mimics和miR-34c-5p mimics于膠質瘤細胞，結果表明miR-34c可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，使細胞周期停滯在S期及G2/M期的，誘導細胞凋亡。miR-34家族與p53形成抗腫瘤正反饋環路：p53由于DNA損傷被激活，活化的p53促使miR-34s表達，從而抑制c-myc、E2F3、Cyclin E2、CDK6、MET、BCL-2等相關蛋白，導致細胞凋亡。同樣miR-34s也可通過抑制組蛋白去乙酰酶SIRT1，從而促進p53因乙酰化而活化[15]。

注：A：對照組；B：miR-34c模擬物組；C：miR-34c抑制物組。圖4 調節miR-34c表達水平對Tca8113細胞遷移的影響(× 40)Note. A: Control group; B: miR-34c mimics group; C: miR-34c inhibitor group.Figure 4 Effect of miR-34c on the migration of tongue cancer cell line Tca8113 cells

為了進一步研究miR-34c在口腔癌中的作用機制，本研究通過體外轉染miR-34c mimics和miR-34c inhibitor，探討miR-34c對口腔癌Tca8113細胞中的生物學行為的影響。于轉染48 h后利用qPCR檢測轉染效率，miR-34c模擬物組和抑制物組miR-34c的表達量較對照組都差異有顯著性，提示轉染成功。脂質體轉染的轉染效率高，但也存在會對細胞產生毒性的問題，于轉染24 h后CCK-8和劃痕實驗結果表明，細胞活力和遷移距離都有降低的趨勢，轉染條件還需進一步優化。我們的實驗結果表明，細胞轉染72 h后miR-34c對細胞具有抑制增殖和遷移的作用，在高寧[16]、王萌[17]、李甫鑰[18]和張金霞[19]的實驗中都得到了類似的結論，高表達miR-34c可抑制細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡。轉染miR-34c在不同細胞中發揮作用的時間不同，武震東[14]的實驗結果表明：上調miR-34c 48 h后，可抑制膠質瘤的增殖、遷移和侵襲能力，這可能是由于腫瘤異質性造成的。miR-34c在多種腫瘤中表達下調，提示miR-34c有潛在的抑癌作用，這與我們的實驗結果一致，但我們的高通量測序結果表明miR-34c在癌組較正常組高表達，這需要我們進一步明確其機制來作出判斷。腫瘤的發生是多基因協同作用的結果[20]，miRNA存在個體差異[15]，口腔癌的組織學表型和染色體分析的結果表明口腔癌中存在不同表型的腫瘤細胞[21-22]。miR-34c作為口腔癌的標志物投入臨床使用仍需進一步的探究和驗證。

介于miRNA的特性，通過調控其表達抑制腫瘤是目前腫瘤治療的新策略。以miRNA為基礎的基因治療進入了一個新的階段，有很大的應用前景[23]。在miR-34的表達受到抑制或下調的情況下，可通過合成miR-34類似物，增加miR-34的表達；或在miR-34異常表達導致病變時，可利用反義寡核苷酸直接結合miR-34阻斷其活性，從而發揮治療作用[24]。

注：中國地鼠(Cricetulusbarabensisgriseus)是倉鼠科倉鼠亞科動物，在公開出版物中使用倉鼠作為名稱更為科學。但鑒于目前我國實驗動物國家標準中提到的動物的種類都是地鼠，作為專業人員能夠清楚該物種在動物分類中地位，并不妨礙科學研究的成果和使用。中文名稱后面的拉丁文不會對該研究的主體產生歧義，故本文在發表時仍沿用“中國地鼠”，待國標修訂后再統一命名為“倉鼠”。