膠原誘導與抗原誘導C57BL/6小鼠類風濕關節炎造模的比較研究

范凱健，吳 菁，王婷玉*

(1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科，上海 200011； 2.上海市寶山區中西醫結合醫院藥劑科，上海 201901)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、進行性的自身免疫系統疾病，其特征主要是滑膜的長期慢性炎癥，從而造成軟骨以及骨關節結構的逐漸破壞。RA影響超過1%的人群，并導致患者的生活質量明顯下降[1]。RA具有多樣的臨床癥狀，因此許多實驗動物模型試圖模仿這種疾病的多種臨床特征。目前，研究者已經開發了許多關節炎模型，并且這些模型成為闡明RA疾病發展過程和開發新藥的非常有用的工具[2-4]。許多轉基因小鼠需要在C57BL/6小鼠背景下繁殖，因此在此小鼠背景下的疾病造模研究就顯得尤為重要。轉基因小鼠的研究將更廣泛地揭示疾病的分子機制，并且能為可能的治療方法提供驗證。本實驗將研究C57小鼠背景下，膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)和抗原誘導的關節炎(antigen-induced arthritis，AIA)的造模情況。

注：A：兩側股骨頭對應的外部皮膚皮內注射；B：膝關節腔內注射。圖1 AIA模型造模注射部位Note. A: Intradermal injection to the external skin corresponding to the femoral head on both sides. B: Intra-articular injection of the knee joint.Figure 1 Injection sites for modeling of the AIA model

1 材料和方法

1.1 實驗動物

AIA組8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠(體重：20～25 g)21只，CIA組10～14周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠(體重：25～30 g)21只，由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物房所提供[SCXK (滬) 2013-0016]。常規飼養于擁有獨立通氣籠盒(individual ventilated cages，IVC)的動物房，12 h光照和夜循環，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%[SYXK (滬) 2016-0016]。實驗期間，遵循3R原則給予實驗動物人道主義關懷。動物實驗的開展取得了上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物倫理委員會批準(編號：HKDL[2017]207)。

1.2 主要試劑與儀器

4 mg/mL雞II型膠原,Chondrex公司，批號170376；5 mg/mL(Chondrex公司，批號170670)和10 mg/mL(Chondrex公司，批號170666)的完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)；冰醋酸溶液；甲基化的牛血清白蛋白(methylated bovine serum albumin,mBSA)；磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS)。游標卡尺(無錫錫豐有限公司)，電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)，微量進樣器(上海高鴿工貿有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 AIA造模方法

選用8周齡雄性C57BL/6小鼠在第0天時，將100 mg mBSA溶解于50 μL PBS中，再與50 μL CFA混合乳化，最后在兩側股骨頭對應的外部皮膚皮內注射(圖1A)。在第7天時，同樣的劑量在尾根部皮內多點注射。在第21天時，將10 μg mBSA溶于5 μL PBS中后注射于左側膝關節腔內，右側膝關節腔內則注射同等劑量的PBS(圖1B)。

1.3.2 CIA造模方法

選用10～14周齡雄性C57BL/6小鼠，將4 mg/mL雞的II型膠原冰醋酸溶液，與6.67 mg/mL的CFA按照1: 1混合乳化后分別在第0天和第14天于小鼠尾根部皮內多點注射0.1 mL。

1.3.3 膝關節、踝關節的腫脹度和體重的監測

對于CIA模型，從第0天開始，用電子稱對小鼠進行稱重，用游標卡尺測量踝關節和膝關節的直徑，每周測量兩次，一共測量四周。對于AIA模型，從第0天開始，用電子稱對小鼠進行稱重，用游標卡尺測量膝關節的直徑，連續測量一周。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 CIA模型

表1 CIA與AIA模型造模比較

從圖2A可以看出，模型組相對于正常組，體重會明顯減輕，且在第7、12和17這三天的結果差異有顯著性。在此次實驗中，正常組3只，模型組18只(表1)。模型組中5只出現嚴重關節炎癥狀，2只出現輕微關節炎癥狀，1只第一次造模后死亡。5只出現嚴重關節炎癥狀的小鼠中，只有1只四肢都出現嚴重的關節炎癥狀。從圖2C可以看出，第7天開始，模型組小鼠踝關節開始出現關節炎癥狀，且在第17天達到高峰后慢慢減輕。從圖2B可以看出，模型組與正常組膝關節的差異不明顯，只有在第20天才出現明顯差異。綜上，CIA模型關節炎癥狀最先累及踝關節(圖3)，后遷延至膝關節，且癥狀持續時間較久。

注：A：體重；B：膝關節腫脹度；C：踝關節腫脹度。與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖2 CIA模型組與正常組比較Note. A: Body weight. B: Swelling degree of the knee joint. C: Swelling degree of the ankle joint. Compared with the normal group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 2 Comparison of the CIA model and normal groups

圖3 CIA模型造模成功后小鼠后爪Figure 3 Mouse hind paw after successful CIA model establishment

2.2 AIA模型

從圖4A可以看出，模型組與正常組體重差異無顯著性。在此次實驗中，正常組3只，模型組18只(表1)。其中模型組10只出現嚴重的關節炎癥狀，7只出現輕微的關節炎癥狀，1只加強造模前死亡。圖4B可以看出，模型組從第1天開始出現嚴重的關節炎癥狀，直至第3天開始慢慢消退。從圖4C可以看出，模型組注射PBS的右膝關節與正常組無明顯差別。綜上，AIA模型關節炎癥狀主要是在膝關節(圖5)，且維持較短。

注：A：體重；B：膝關節腫脹度(左)；C：膝關節腫脹度(右)。與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖4 AIA模型組與正常組比較Note. A: Body weight. B: Swelling degree of the knee joint (left). C: Swelling degree of the knee joint (right). Compared with the normal group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 4 Comparison of the AIA model and normal groups

圖5 AIA模型造模成功后膝關節Figure 5 Knee joint after successful AIA model establishment

3 討論

CIA是在1980年首次由CII誘導的小鼠模型[5]，從此成為關節炎中使用最廣泛的關節炎模型之一。通過免疫接種，在遺傳易感性小鼠品系中極易引發CIA。在CIA模型中，小鼠會出現與RA相似的慢性骨侵蝕和滑膜炎癥[5]。但該模型與RA之間最顯著的差異在于CIA中不存在類風濕因子，且實驗性疾病一般是單相的。CIA經典模型是DBA/1(H-2q)小鼠品系，在我們團隊以前的實驗中此品系小鼠造模成功率100%。本實驗中，我們是在C57BL/6背景下造CIA模型。由于B6小鼠的主要組織相容性(major histocompatibility，MHC)的特異性，導致較低的發病率和較高的差異性[6]。對于在B6背景下CIA造模的研究，國外已經有多支團隊研究過。在Ikic[7]等人的實驗中，是選用的8～10周齡小鼠且加強注射選在第21天，加強時選用不完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，IFA)而非CFA。他們通過對大約200只小鼠造模，研究發現，造模成功率在50%左右。在我們團隊的實驗中，B6小鼠的造模成功率是41%，與國外團隊成功率差不多，但還是遠低于DBA小鼠的造模成功率。且B6小鼠的關節炎嚴重程度差異性大，一般只有后爪腫脹，而在DBA背景下造模，基本都會出現四肢嚴重的關節炎癥狀。由此可見，B6背景下的CIA造模差異性較大，無法出現比較一致的關節炎癥狀。

AIA是通過mBSA免疫動物并局部誘發關節炎的產生。它是一種由T細胞介導的關節炎癥，其受累關節的組織病理學與RA有許多相似之處。但由于炎癥局限在膝關節周圍，AIA并不是RA的一個完整模型。由于組織學的差異性，AIA引起的炎癥相對于RA引起的滑膜炎癥，炎癥過程更加快速但結締組織也更快速的分解[8]。在本次實驗中，膝關節從第一天開始就出現嚴重的關節炎癥狀，并持續三天，后癥狀逐漸減輕。在此次實驗中，AIA的造模成功率為100%，明顯高于CIA的造模成功率。mBSA是一種高密度陽離子蛋白質，能被軟骨表面所吸附，因此可以延長其關節炎癥狀[9]。此外，膝關節腔內有限的空間也能導致mBSA誘發嚴重的關節炎。綜上，B6背景下的AIA造模成功率高，嚴重程度高，但關節炎癥狀維持時間短，不利于研究RA的慢性關節炎機制。雖然AIA模型不是RA的完整模型，但對研究關節炎局部細胞之間的相互作用還是很有價值的[10]。

在B6背景下，CIA的造模成功率低，且差異性較大，但后爪關節炎癥狀嚴重且維持時間久。CIA模型在免疫學和病理學上更類似于RA，因此適合研究RA對機體整體的影響。而AIA作為單側關節炎。優點是關節炎的確切起點，100%的發生率和重現性好。因此AIA模型適合于關節疼痛的研究。兩種模型之間各有優缺點，適合不同的實驗需求。通過對B6背景下兩種模型的相互比較，為了更全面的研究RA的致病機制，可能更適合在后續的轉基因小鼠身上造CIA模型。