梔子苷對乳腺炎動物模型IL-6、TNF-α和IL-1β表達的影響

黃永周，李 漪，叢竹軍

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆 石河子 832000)

乳腺炎是急性、化膿性感染導致乳腺管及周圍結締組織發生炎癥的疾病，以乳腺組織炎性細胞浸潤、內皮功能受損、大量促炎細胞因子分泌為主要特點，是哺乳動物泌乳期常見疾病，臨床癥狀以局部疼痛和腫塊為主，病情加重才出現發熱等全身癥狀，嚴重者可出現敗血癥，威脅患者生命安全[1]。急性乳腺炎臨床多由金黃色葡萄球菌和鏈球菌等致病菌導致，臨床采用抗生素治療，近年來，隨著抗生素的廣泛應用，細菌耐藥現象時有發生，降低了臨床治療[2]。梔子是常見的中藥，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效，具有明確的抗炎和抗內毒素作用，但對乳腺炎是否有治療效果尚需要進一步研究探討[3]。本研究建立脂多糖誘導的小鼠乳腺炎模型，觀察梔子苷對模型乳腺組織及乳腺上皮細胞中IL-6、TNF-α和IL-1β表達的影響，進一步探討梔子苷在乳腺炎治療中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級的ICR雌性小鼠40只和雄性小鼠20只，8～10周齡，體重22～25 g，均購自石河子大學醫學院實驗動物中心[SCXK (新) 2017-118]，飼養于石河子大學醫學院實驗動物中心[SYXK (新) 2017-142]，按照2∶1比例將雌性小鼠和雄性小鼠隨機合籠飼養，恒溫、恒濕條件下飼喂，全價日糧，自由采食和飲水，飼養至母鼠分娩，分娩后5～7 d開始實驗，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。新疆石河子大學醫學院實驗倫理委員會批號：2017-0032。

1.2 主要試劑與儀器

梔子苷(純度> 99%)購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；脂多糖購自北京寰宇科創生物科技發展有限公司；IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購自北京奧維亞生物技術有限公司；TRIzol購于美國Invitrogen公司；DHEA購于Fluka公司；RevertAIDTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒購于Fermentas公司；聚合酶鏈反應試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；IL-6、TNF-α和IL-1β引物序列由大連寶公司合成。紫外分光光度計購自濟南海能儀器股份有限公司；DM3000生物顯微鏡購自德國徠卡公司；熒光定量PCR系統購自上海生物科技儀器廠；電泳儀DYY-6C購自南京萊步儀器廠；SpectraMax iD5-多功能酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物造模

小鼠分娩后5～7 d，將40只ICR雌性小鼠隨機分為空白對照組、模型組、脂多糖低劑量組(L組)、脂多糖中劑量組(M組)和脂多糖高劑量組(H組)，每組8只。模型組、L組、M組、H組四組參照文獻[4]的方法，取第四對乳頭消毒后乳導管灌注50 μg濃度為0.2 mg/mL的脂多糖，空白對照組注射等量的磷酸緩沖鹽溶液。L組、M組、H組分別注射25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的梔子苷，模型組和空白對照組注射等量的磷酸緩沖鹽溶液，建模后24 h處死小鼠。

1.3.2 標本采集

采用頸椎脫臼處死小鼠，常規消毒小鼠皮膚，解剖剪剪開腹部皮膚，剝離開皮膚，充分暴露第四對乳腺組織，剝離乳腺組織并儲存于-80℃條件。

1.3.3 HE染色

每組取一份乳腺組織采用4%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗固定好的組織采用梯度酒精脫水，放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中直至組織呈透明狀態，隨后以石蠟包埋組織進行切片、烘干、脫蠟，最后行蘇木精-伊紅染色和封片，顯微鏡下觀察組織形態。

1.3.4 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平檢測

收集100 mg乳腺組織，TRIzol提取RNA，并采用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，利用Primer Premier 5.0設計TNF-α、IL-1β、IL-6和β-actin內參基因的引物序列：TNF-α：上游：5’-GTCTCAGC CTCTTCTCATTC-3’，下游：5’-CATAGAACTGAT GAGAGGGA-3’，產物長度：128 bp；IL-1β：上游：5’-AAATACCTGTGGCCTTGGGC-3’，下游：5’-CTTGG GATCCACACTCTCCAG-3’，產物長度：101 bp；IL-6：上游5’-GAGTCCTTCAGAGAGATACAG-3’，下游：5’-CTGTGACTCCAGCTTATCTG-3’，產物長度：125 bp；β-actin：上游：5’-CTTCATTGACCTCAACTAC ATGG-3’，下游：5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGT GAT-3’，產物長度：134 bp。

1.3.5 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平檢測

收集100 mg乳腺組織，按1∶9比例加入磷酸緩沖鹽溶液，碎冰上勻漿，3000 r/min離心15 min，移液槍去除上層乳白色脂肪組織，收集上清液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平，嚴格按照說明操作。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠乳腺組織HE染色結果

空白對照組乳腺組織腺泡上皮排列整齊，模型組乳腺腺泡結構崩塌，乳腺上皮脫落或壞死，乳腺小葉間隔變寬度；L組、M組、H組給藥后炎性細胞浸潤明顯減少，間質水腫緩解。見圖1。

2.2 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平檢測結果比較

模型組、L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著高于空白對照組(P< 0.05)；L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著低于模型組(P< 0.05)；M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著低于L組(P< 0.05)；H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著低于M組和L組(P< 0.05)。見表1。

注：圖中箭頭處為乳腺炎癥浸潤病變。標尺=50 μm。圖1 小鼠乳腺組織HE染色結果(× 200)Note. Arrowheads indicate the infiltrative lesion of mastitis. Bars=50 μm.Figure 1 Histological changes in the mouse mammary gland tissues.HE staining

表1 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平±s，n=7)

注：與空白對照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與L組相比，△P< 0.05；與M組相比，&P< 0.05。

Note. Compared with the blank control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the L group,△P< 0.05. Compared with the M group,&P< 0.05.

表2 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平±s，n=7)

注：與空白對照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與L組相比，△P< 0.05；與M組相比，&P< 0.05。

Note. Compared with the blank control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the L group,△P< 0.05. Compared with the M group,&P< 0.05.

2.3 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平

模型組、L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著高于空白對照組(P< 0.05)；L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著低于模型組(P< 0.05)；M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著低于L組(P< 0.05)；H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著低于M組和L組(P< 0.05)。見表2。

3 討論

研究乳腺炎需要規范化和標準化的動物模型，有報道顯示奶牛、奶山羊、兔、小鼠、大鼠等動物均可用于制作乳腺炎病理模型[5 - 6]。小鼠價格低廉，成本低，重復性好，國內外乳腺炎模型多采用小鼠建立乳腺炎模型[7]。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌常用作乳腺炎模型的誘導細菌，但菌體結構復雜，缺乏一致性和重復性[8]。脂多糖是大腸埃希菌細胞壁外膜主要成分，可通過細胞信號轉導系統激活單核巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞等合成和釋放多種細胞因子和炎性介質，誘導乳腺炎，具有良好的一致性和重復性[4]。本研究采用小鼠作為乳腺炎病理模型研究實驗動物，用脂多糖誘導乳腺炎動物模型，解穎穎等[4]研究顯示，10、20、40、50 μg脂多糖注射后24 h均可誘導不同程度乳腺炎病理模型，本研究參考其結果，取50 μg脂多糖注射后24 h進行觀察。

細胞因子在免疫和炎癥反應中發揮重要作用，脂多糖可誘導乳腺局部炎癥組織浸潤，導致TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子釋放增加，炎癥因子釋放增加一方面可趨化免疫細胞清除病原體，但炎癥反應進展可引起乳腺微循環障礙，導致乳腺組織壞死、化膿，控制乳腺炎患者炎癥反應對治療具有重要作用[9]。此外，研究表明，脂多糖作用下TNF-α、IL-6、IL-1β等細胞因子含量增加，導致單核吞噬細胞、中性粒細胞集聚，誘導并促進前列腺素、溶酶體酶和過氧化氫類物質等的釋放，引起或加重炎癥[10]，所以TNF-α、IL-6、IL-1β不僅可作為診斷炎性反應的重要實驗室指標，也可作為反映治療效果與炎性狀態的重要參考指標。本研究結果顯示，與空白對照組比較，脂多糖誘導的小鼠乳腺炎模型乳腺組織中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA水平和蛋白水平顯著增加。

因為抗生素的毒副作用和耐藥性，治療乳腺炎臨床應用受到一定限制，傳統中藥具有多靶點作用，在炎癥治療中發揮積極作用。中醫無急性乳腺炎之病名，多根據臨床癥狀將其歸于“乳癰”范疇，病機主要為乳汁於積，乳絡阻塞成塊，郁久化熱釀膿而成癰腫，早期紅腫熱痛表現明顯，熱毒與炎癥在病理、病機、治則方面具有密切聯系，治療以清熱解毒、散結消腫為主[11]。梔子是臨床常用清熱解毒中藥，梔子苷是梔子的有效成分，體外培養脂多糖誘導損傷的大鼠巨噬細胞，應用梔子苷治療可降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子釋放[12]。Yang等[13]采用脂多糖誘導制造肺炎小鼠模型，采用梔子苷進行治療，結果顯示，梔子苷治療可顯著降低IL-4、IL-5、IL-13和細胞黏附分子表達。Shi等[14]研究則顯示，梔子苷的抗炎機制可能與其抑制NF-κB、TLR4、MMP9表達和減少前炎癥細胞因子有關。本研究結果顯示，L組、M組和H組小鼠炎性細胞浸潤明顯減少，間質水腫緩解，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平和蛋白水平顯著低于模型組，且隨著劑量增加，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平和蛋白水平逐漸降低，呈負相關關系，結果提示，梔子苷可抑制脂多糖誘導的乳腺炎癥損傷，有降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子水平的作用。

本研究的不足之處在于：①初步闡明了梔子苷可抑制乳腺炎動物模型乳腺組織炎癥因子表達，梔子苷通過何種機制發揮抑制炎癥因子表達的作用尚需要進一步研究探討；②本研究設計前，經查詢相關文獻，未查找到良好的在臨床或實驗室具有同樣或類似藥理作用機制的陽性藥物，本研究實驗中未設置陽性對照組，在下一步闡明梔子苷抑制炎癥因子作用機制的研究中，將設置陽性對照組進一步研究探討。