SD大鼠肢體缺血-再灌注損傷模型的建立

申 震，朱付平，潘成熙，羅偉業，周富強，李武平

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007)

缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷是臨床中一種常見的復雜的病理過程，是指缺血一段時間后，重新恢復血流，組織損傷程度反而進一步加重，器官功能進一步惡化的綜合征[1]。IR主要影響O2依賴性器官，如肝臟、腎臟、心臟、腦、腸道以及骨骼肌等[2]，多見于器官移植術、冠狀動脈成形術、溶栓治療以及擠壓傷、四肢血管損傷、斷肢再植、骨筋膜間室綜合癥等骨科疾病[3 - 4]。相較于其他器官，骨骼肌研究較少，但骨骼肌對缺血卻十分敏感[5]，文獻報道[6]，缺血時間超過2.5 h血流再通就會導致肢體缺血-再灌注損傷(limb ischemia-reperfusion injury，LIRI)，尤其是線粒體等重要代謝細胞器會發生不可逆轉的病理改變。近年來，由骨骼肌缺血復灌導致的LIRI的發病率、致殘率乃至病死率呈逐年上升的趨勢，若沒有進行及時有效的治療，對患者的損害程度極大，嚴重者引發遠隔臟器損傷[7 - 8]，甚至誘發全身炎癥反應綜合征或多器官功能不全綜合征，給患者個人及社會帶來沉重的負擔[9]。故而，構建LIRI模型并研究LIRI發病機制以及防治要點具有重要的現實意義。

然而，當前LIRI模型的構建方法主要是通用無創血管夾夾閉或無創縫合線結扎股動脈進行缺血再灌注操作[10]。這種方式對動物損傷較大，無菌條件要求高，操作精細復雜，耗時較長，且易出現切口感染，誤傷神經血管等問題，成功率較低。鑒于以上因素，本研究改良而成一種應用于SD大鼠LIRI模型的構建方法，并進行骨骼肌組織形態學等相關檢測，以評價模型的可靠性，現介紹如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗選用15只2月齡SPF級SD雄性大鼠，體質量(232.50±6.00) g，各組間比較差異無顯著性(P> 0.05)，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK (湘) 2013-0004]，飼養及實驗操作在湖南中醫藥大學動物實驗研究中心[SYXK (湘) 2013-0005]，實驗室溫度20℃～24℃，相對濕度60%～70%。實驗動物予以常規飼料喂養，自由飲水。本實驗嚴格遵守國家實驗動物福利倫理相關規定，科研項目倫理審查意見號：HN-LL-GZR-201609，實驗中對動物處置符合科技部頒行的《關于善待實驗動物的指導性意見》，滿足動物保護、動物福利以及倫理原則的相關要求，嚴格遵守動物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅染色(HE)液(廣州，凱秀貿易有限公司)；4,6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI，美國，Sigma公司)；戊巴比妥鈉(美國，Sigma公司)。市售統一規格橡皮圈，尼龍扎帶，50 mL注射器；BX51型正置熒光顯微鏡(日本，Olympus公司)。

1.3 實驗方法

SD大鼠按照隨機數字表法隨機分為正常組，缺血再灌注0 h組、2 h組、4 h組以及8 h組5個組，每組3只。所有SD大鼠術前禁食禁飲12 h，3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉。正常組大鼠不阻斷血流，缺血再灌注0 h組、2 h組、4 h組以及8 h組各組大鼠采用50 mL注射器自制成套管及市售統一規格橡皮圈復制SD大鼠右后肢缺血-再灌注損傷模型。既要達到阻斷血流目的，又要避免橡皮圈對骨骼肌的直接損傷，經摸索實驗選取直徑0.8 cm和1.0 cm橡皮圈各一個，并將橡皮圈套在大鼠大腿根部，并用尼龍扎帶系在橡皮圈下阻擋橡皮圈向下滑動，尼龍扎帶不對骨骼肌產生壓力，當大鼠趾掌變得蒼白青紫、發涼，即是股動脈血流被成功阻斷，大鼠趾掌由暗紫色又轉為粉紅色則為恢復血流灌注。具體步驟如下：

①制備長度為2 cm，內徑為2 cm的塑料套管，外覆軟布圈(以防壓力集中使肌肉斷裂)，將直徑0.8 cm和1.0 cm橡皮圈各一個緊密套在塑料管上；

②由助手將大鼠固定牢靠，將大鼠右后肢充分套入上述制備完畢的塑料管內(使橡皮圈能從大腿根部阻斷血流)，然后拉動軟布圈使其帶動其上的多個橡皮圈一起退至大鼠右后肢大腿根部，橡皮圈因彈性回縮壓迫股動脈而阻斷右后肢的血流(阻斷大鼠后肢血流的標志是趾掌變得蒼白青紫、發涼)；

③大鼠右后肢阻斷血流的時間為4 h以實現肢體處于缺血狀態，然后依次于缺血后0 h、2 h、4 h和8 h用手術刀片分別切斷橡皮圈，恢復血流灌注，構建缺血-再灌注損傷模型，并可輕柔按摩橡皮圈固定處以利于恢復血液的灌注(見圖1)，并依次于缺血后再灌注0 h、2 h、4 h和8 h四個時間點，在大鼠處于麻醉狀態下采用頸椎脫臼法將其處死，收集腓腸肌，經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片等操作后行HE染色和DAPI染色，光鏡下觀察腓腸肌組織結構的病理學變化。

注：a：造模所需元件及組裝；b：阻斷右后肢股動脈血流側位圖；c：阻斷右后肢股動脈血運前后位圖；d：維持缺血狀態4 h，右側趾掌變得蒼白青紫、發涼。圖1 大鼠肢體缺血-再灌注損傷模型操作示意圖Note. a: Materials and assembly for the model; b: Blocking blood flow of the right femoral artery in the lateral position; c: Blocking blood flow of the right femoral artery in the anteroposterior position; d: Pale and cool paw on the right hind limb during the ischemic state for 4 hours.Figure 1 Operational diagram of the establishment of the rat LIRI model

2 結果

2.1 肢體骨骼肌大體形態觀察

依次于缺血后再灌注0 h、2 h、4 h和8 h四個時間點處死大鼠，然后沿大鼠右后肢縱軸方向剪開皮膚，鈍性分離皮膚軟組織等淺筋膜，切掉深筋膜，暴露腓腸肌。正常組3只大鼠腓腸肌鮮活紅潤，肌組織結構輪廓清晰；與正常組比較，再灌注0 h組、2 h組、4 h組及8 h組共計12只大鼠(每組3只，沒有未納入分析的大鼠)右后肢腓腸肌均有不同程度腫脹、瘀青，肌組織結構模糊、暗淡，組織液化壞死等表現，而且隨著時間的進展損傷逐漸加重(見圖2)。

注：a：正常組；b：0 h組；c：2 h組；d：4 h組；e：8 h組。圖2 后肢大體解剖形態觀察圖Note. a: Normal group; b: 0 h group; c: 2 h group; d:4 h group; e:8 h group.Figure 2 Gross appearance of the mouse hind limbs

2.2 HE染色結果

光鏡下對各組腓腸肌進行形態學觀察，正常組3只大鼠腓腸肌細胞輪廓正常，胞膜完整，肌纖維排列整齊，結構清晰(見圖3a)；與正常組相比，0 h、2 h、4 h和8 h組所有大鼠(每組3只，共計12只)右后肢腓腸肌肌纖維結構均出現異常，肌纖維排列紊亂、增粗、腫脹或部分肌纖維完整性、連續性遭到破壞，肌纖維變細、斷裂或肌纖維間縫隙增寬，肌纖維間炎性浸潤，但各組損傷程度不一，其中0 h組和2 h組損傷程度較輕，而4 h組和8 h組較嚴重；4 h與8 h兩組正常骨骼肌細胞明顯減少，變性或壞死的骨骼肌細胞明顯增多(見圖3b～3e)。

注：a：正常組；b：0 h組；c：2 h組；d：4 h組；e：8 h組。圖3 腓腸肌染色形態光鏡圖(HE染色，× 200)Note. a: Normal group; b: 0 h group; c: 2 h group; d:4 h group; e:8 h group.Figure 3 Histology of the mouse gastrocnemius muscle. HE staining

2.3 DAPI染色結果

正常組3只大鼠腓腸肌細胞核呈圓形或橢圓形形狀，邊緣輪廓清晰，染色均勻(見圖4a)；除正常組外，其余4組所有大鼠(共計12只)右后肢腓腸肌細胞內均可見凋亡小體,即核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細胞膜所包繞，細胞核邊緣不規則(見圖4b～4e)，其中尤以4 h和8 h兩組最為明顯；此外，4 h組中3只大鼠和8 h組中3只大鼠的腓腸肌細胞著色較重，核出現濃縮、呈新月形聚集于核膜一邊(見圖4c～4d)。

注：a：正常組；b：0 h組；c：2 h組；d：4 h組；e：8 h組。紅色箭頭指示凋亡小體；黃色箭頭指示核濃縮和新月形細胞核。圖4 腓腸肌細胞核熒光染色圖(DAPI染色，× 400)Note. a: Normal group; b: 0 h group; c: 2 h group; d:4 h group; e: 8 h group. Red arrowhead: apoptotic body; Yellow arrowhead: nuclear enrichment and crescent nucleus.Figure 4 Fluorescence images of cell nuclei of the gastrocnemius muscle. DAPI staining

3 討論

Jennings等[11]于1960年在心肌的研究中最早提出了缺血-再灌注損傷概念。之后諸多實驗證實缺血再灌注損傷也可在心、腦、肝、腎、骨骼肌等其他器官組織中發生。近些年，有關缺血-再灌注損傷模型的構建方法，在大鼠、小鼠、兔、豬等實驗動物上均有報道，然而，無論是在常見的心、腦、肝、腎、腸道缺血-再灌注損傷模型[12 - 17]中，還是在骨骼肌缺血-再灌注損傷模型[18]中，大都均采用較為復雜的、開放有創的造模方法，即依次切開皮膚、皮下組織，顯露動脈、靜脈和神經，用顯微器械分離動脈，通過無創血管夾夾閉或無創縫合線結扎相應的營養動脈造成器官缺血，然后放開血管夾或剪斷縫合線，恢復阻斷區血供誘發再灌注損傷。然而，這種切開皮膚軟組織，游離營養血管再結扎的開放造模方法，操作精細復雜，耗時較長，不僅對實驗人員造模技術要求較高，而且對實驗動物損傷較大。此外，在造模過程中對無菌條件要求高，易出現切口感染，誤傷神經血管等問題，造模成功率較低。

而本實驗中所描述的LIRI模型是在張連元等[19]介紹的方法基礎上，加入自制注射器套筒，精簡步驟，細化操作，在大鼠體外閉合阻斷股動脈血流誘發肢體缺血-再灌注損傷的一種方法。本造模方法血流阻斷部位在股骨近端，而取材部位是脛腓骨后面的腓腸肌，故而避免橡皮圈對腓腸肌的直接損傷，腓腸肌結構形態上的異常變化應是由阻斷股動脈血運再復灌血流而誘發骨骼肌發生缺血-再灌注損傷所導致。與當前采用較多的開放有創的造模方法相比，本方法具有簡便、快捷、安全、可靠等優點。本方法在體外阻斷股動脈，一方面實驗人員無需進行系統、精細的外科操作培訓，另一方面對無菌條件要求相對較低，且對大鼠本身損傷較小，避免了因切開皮膚軟組織造模而產生的出血、感染、誤傷血管和神經等問題，不僅可以降低風險，而且在保障造模質量的前提下，通過改進實驗方法盡可能地減輕了對實驗動物的損害，這正是善待實驗動物、提高動物福利，遵循“減少、替代、優化”3R原則的具體體現。在本實驗中，再灌注0 h、2 h、4 h和8 h四組骨骼肌均出現了不同程度肌纖維腫脹、炎性浸潤、肌纖維排列不規則、變細、間隙增寬，甚至肌纖維斷裂等異常情況，表明在缺血-再灌注過程中骨骼肌結構形態表現異常，骨骼肌出現不同程度損傷，其中4 h和8 h兩組損傷程度較之0 h和2 h兩組顯著加重，且8 h組損傷程度最為嚴重，說明骨骼肌損傷隨時間進展性加重，缺血時間拖延越久，骨骼肌損傷越嚴重，LIRI危害也就越大，這或許就是LIRI“早期、及時、全程”治療思路的實驗依據。此外，四組的骨骼肌細胞表現出典型的凋亡形態學特征，這與在LIRI過程中有細胞凋亡機制參與的論述相一致[20 - 21]，表明在一定的病理條件下，如骨骼肌處于缺血缺氧環境中，骨骼肌細胞可以發生細胞凋亡現象，在LIRI過程中長時間的缺血缺氧狀態導致了核細胞自身啟動細胞內特定的程序誘發細胞自然死亡。凋亡的細胞體積則會整體縮小，細胞膜變得皺縮，或形成許多突起分割包裹胞質，亦或核體皺縮，染色體致密，形成凋亡小體，細胞核最終破裂、解體。

綜合上述，本造模方法構建的模型符合LIRI損傷過程中骨骼肌的病理變化特點，與LIRI臨床特征相似。且該模型操作簡便、快捷、模型結果質量可靠，從而為系統研究LIRI的病因、發病機制及其預防和治療，提供了一種接近臨床、簡便可控的動物建模方法。