用不同劑量的溴氰菊酯對大鼠進行灌胃對其腎細胞DNA的影響

石 微

（江蘇聯合職業技術學院連云港中醫藥分院，江蘇 連云港 222006）

溴氰菊酯（Deltamethrin，DM）屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑[1]。該殺蟲劑具有觸殺迅速，擊倒能力強等特點。近年來，DM被廣泛地應用于農作物蟲害和公共衛生蟲害的防治中。有研究表明，DM可經呼吸道、胃腸道及皮膚黏膜進入人體[2]。隨著DM的廣泛應用，眾多學者致力于研究DM對大鼠中樞神經系統的影響[3]。本主要探討使用不同劑量的溴氰菊酯對大鼠進行灌胃對其腎細胞DNA的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

將40只健康清潔級Wistar大鼠隨機分為空白對照組、橄欖油對照組、DM 1.563 mg/kg組、DM 3.125 mg/kg組和DM 6.250 mg/kg組，每組各有8只大鼠。本次研究中大鼠的體重為180～220 g，購自青島實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

1）溴氰菊酯（純度≥98%）購自南京紅太陽藥業。2）高碘酸、蘇木精購自青島愛普科生物工程有限公司。3）瓊脂糖購自Sigma公司。4）Triton X-100非離子型表面活性劑。5）溴化乙錠熒光染色劑。6）乙二胺四乙酸絡合劑。7）德國SLEECUT5062型石蠟切片機。8）德國SLEES2052/22型全自動脫水機。9）電泳儀。10）熒光顯微鏡。

1.3 灌胃方法

進行灌胃的方法是：1）將這五組大鼠分別放置在24 h自然光照的試驗室中進行適應性飼養。飼養的時間為1周。將試驗室的溫度設置為15～25℃。在此期間，所有大鼠均自由飲水和進食。2）從第8 d開始，每日上午9點對這五組大鼠進行灌胃。為空白對照組大鼠使用5 ml/kg-1·d-1的生理鹽水進行灌胃，為橄欖油對照組大鼠使用5 ml/kg-1·d-1的橄欖油進行灌胃，為DM 1.563 mg/kg組大鼠使用小劑量的溴氰菊酯（1.563 mg/kg-1·d-1）和5 ml/kg-1·d-1的橄欖油混合液進行灌胃，為DM 3.125 mg/kg組大鼠使用中等劑量的溴氰菊酯（3.125 mg/kg-1·d-1）和5 ml/kg-1·d-1的橄欖油混合液進行灌胃，為DM 6.250 mg/kg組大鼠使用大劑量的溴氰菊酯（6.250 mg/kg-1·d-1）和5 ml/kg-1·d-1的橄欖油混合液進行灌胃。1次/d。每灌胃5 d，停止灌胃2 d。連續灌胃24周。3）最后一次灌胃后，大鼠禁食24 h。4）對大鼠進行水合氯醛腹腔麻醉。5）將大鼠放在冰盤上，迅速對其進行解剖，并取出其腎臟。6）用預冷的去離子水對大鼠的腎臟進行沖洗。

1.4 檢測方法

采用石蠟切片技術與HE染色法檢測大鼠腎組織結構的變化。檢測的方法是：1）用濃度為4%的多聚甲醛對大鼠的腎組織進行固定。2）用石蠟包埋大鼠的腎組織，并使用切片機對包埋后的腎組織進行切片，切片的厚度為5 um。3）使用蘇木精對腎組織切片進行染色，染色的時間為10 min，然后，用自來水沖洗腎組織切片1 min。4）使用濃度為1%的鹽酸乙醇對腎組織切片進行分化，分化的時間為30 秒，然后，用自來水沖洗腎組織切片1 min。5）使用濃度為1%的氨水對腎組織切片進行返藍，返藍的時間為30 秒，然后，用自來水沖洗腎組織切片1 min。6）使用濃度為95%的伊紅對腎組織切片進行染色，染色的時間為5 min，然后，用自來水沖洗腎組織切片3～5秒。7）將腎組織切片放置在溫度為37℃的烘干機中進行烘干，然后，用中性樹膠進行封固。采用單細胞凝膠電泳技術檢測大鼠腎細胞尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩[4]。檢測的方法是：1）將大鼠的腎臟剪成細碎的糜狀，并用200目篩網進行過濾，用拋光后的吸管輕輕吹打，使其成為細胞懸液。2）對過濾后的細胞懸液進行離心處理，離心的轉速為800 rpm，離心的時間為5 min。然后，去除上清液。3）使用PBS溶液將大鼠腎細胞的濃度調整為104～105個/ml。4）對大鼠的腎細胞進行制片、避光裂解、解螺旋、電泳、中和及染色。

1.5 統計學處理

使用SPSS17.0軟件對本次研究中的數據進行處理，計量資料用均數±標準差（）表示，采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對五組大鼠腎組織病理切片進行HE染色情況的分析

在進行HE染色后發現，空白對照組大鼠和橄欖油對照組大鼠腎小球的大小正常，其腎小管上皮細胞未出現水腫，其腎小球內足細胞、內皮細胞、系膜細胞的形態均正常。DM 1.56 mg/kg組大鼠和DM 3.125 mg/kg組大鼠部分腎小管上皮細胞出現水腫，其部分腎小球毛細血管出現擴張，其部分腎小球系膜細胞出現增生。DM6.25 mg/kg組大鼠腎小管上皮細胞出現水腫，其腎小球毛細血管出現較為嚴重的擴張，其腎小球系膜細胞出現增生。

2.2 五組大鼠腎細胞DNA損傷程度的比較

在熒光顯微鏡下，未受損的腎細胞DNA以圓形熒光為核心，無明顯的尾部或尾部很短，受損的腎細胞DNA呈彗星狀，尾部由DNA 破裂斷片組成。在本次試驗中，DM 1.563 mg/kg組大鼠、DM 3.125 mg/kg 組大鼠和DM 6.250 mg/kg組大鼠腎細胞尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩均高于空白對照組大鼠，P＜0.05 。與DM 1.563 mg/kg組大鼠、DM 3.125 mg/kg 組大鼠相比，DM 6.250 mg/kg組大鼠腎細胞尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩均更高，P＜0.05。詳情見表1。

表1 五組大鼠腎細胞DNA損傷程度的比較（）

表1 五組大鼠腎細胞DNA損傷程度的比較（）

注：②③與空白對照組相比，P＜0.05；①與空白對照組相比，P＞0.05；②與DM 6.250 mg/kg組相比，P＜0.05。

組別 尾DNA含量（%）尾矩 Olive尾矩空白對照組 1.45 ±1.79 0.16±0.33 0.38±0.46橄欖油對照組 1.57 ±1.82① 0.18±0.23① 0.49±0.37①DM 1.563 mg/kg組 23.18±4.66② 11.31±4.54② 22.12±4.69②DM 3.125 mg/kg組 24.12±6.92② 12.01±6.97② 23.06±7.03②DM 6.250 mg/kg組 38.18±9.53③ 39.04±9.92③ 29.12±5.69③

3 討論

DM屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑。該殺蟲劑進入大鼠體內后，可迅速擴散至其體內的各個器官，經肝臟代謝后，由腎臟排出。在進行HE染色后發現，DM 1.56 mg/kg組大鼠和DM 3.125 mg/kg組大鼠部分腎小管上皮細胞出現水腫，其部分腎小球毛細血管出現擴張，其部分腎小球系膜細胞出現增生。DM6.25 mg/kg組大鼠腎小管上皮細胞出現水腫，其腎小球毛細血管出現較為嚴重的擴張，其腎小球系膜細胞出現增生。這說明，DM所致慢性蓄積中毒可使大鼠的腎組織結構發生改變。DM的用量與大鼠腎組織結構的變化呈正相關。單細胞凝膠電泳技術是一種測定單個DNA損傷的方法。該檢測技術具有靈敏度高、準確率高等特點[4]。本次研究的結果證明，使用不同劑量的溴氰菊酯對大鼠進行灌胃可使其腎細胞DNA受到損傷。DM的用量與大鼠腎細胞DNA損傷的程度呈正相關。