珍珠龍膽石斑魚低溫有水保活條件優化

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(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088)

珍珠龍膽石斑魚(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus)屬鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、斑魚屬(Epinephelus),主要分布于我國東南沿海,是目前養殖的主要品種之一,且營養豐富,是一種暖水性的大中型海洋高檔名貴魚類[1],深受消費者和養殖者青睞[2],但因分布地區的局限性,難以滿足實際需求,而且其性格暴躁,背部和腹部有尖刺,運輸過程中環境的變化會使其產生應激反應,劇烈掙扎,易受傷[3]。對其保活運輸的研究報道較少,田朝陽[4]通過運輸機組對石斑魚的長距離運輸技術進行了研究,存活時間長達48 h,成活率100%,但技術參數要求高。

對魚類保活運輸的研究表明:低溫條件下,可使魚類達到休眠或深度鎮靜狀態,使魚體內各種酶的活性降低,進而降低應激反應和新陳代謝水平,從而減緩水質惡化及運輸過程中帶來的機械損傷[5-6],從而達到延長魚類存活時間、改善運輸后魚體品質的目的。Jag等[7]指出,在水溫較低的條件下,魚類的活動量大大減少,能減緩魚類的代謝作用。劉偉東[8]在低溫有水條件下對大菱鲆的存活時間進行研究,結果表明大菱鲆有水保活72 h成活率達到100%,但未提及保活密度。白艷龍[9]對黃顙魚的低溫無水保活進行了研究,結果表明:暫養48 h后,在低溫充氧條件下可保活24 h。由此可見保活密度、溫度、暫養等對魚類的保活運輸具有重要影響,對其研究具有重要意義。本文以珍珠龍膽石斑魚為研究對象,探討了不同溫度、暫養時間、保活密度、降溫模式等條件對石斑魚保活的影響,確定了最佳的保活條件,以期為石斑魚成魚的保活運輸奠定基礎,同時為我國海水魚成魚的保活運輸提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

珍珠龍膽石斑魚(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus) 湛江市水產市場,體表無損傷,健康無病害,體重為480～510 g/尾,充氧帶水運輸至實驗室;白蛋白、球蛋白、皮質醇、血糖、甘油三脂、谷丙轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、尿素氮、肌酐試劑盒 南京建成生物工程研究所;納氏試劑 生化試劑,天津久木科技有限公司;四水合酒石酸鉀鈉、氯化銨 分析純,西隴科學股份有限公司;MS-222麻醉劑 分析純,上海源葉生物科技有限公司。

FIM-120G顆粒制冰機 上海弗格森制冷設備有限公司;Cary 60 紫外分光光度計 安捷倫科技有限公司;5810R 臺式高速大容量離心機 艾本德中國有限公司;Var i oskan 全自動酶標儀 塞默飛世爾科技中國有限公司;PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;DDS-307A 電導率儀雷磁 上海儀電科學儀器股份有限公司;電子稱 廣東香山衡器集團股份有限公司;冷風式冷庫機組 東莞市科安制冷設備有限公司,溫度范圍4～25 ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 石斑魚的前處理 本試驗在2017年7月進行。珍珠龍膽石斑魚自市場購買回來后,置于暫養池中,魚體暫養密度50 g/L,海水鹽度23‰～25‰,水溫23～25 ℃,采用砂濾循環海水(1100 L/h),空氣泵充氧(100 L/min),保證水體溶解氧為5～8 mg/L,暫養一定時間后用于試驗。

1.2.2 單因素實驗 珍珠龍膽經過一定暫養時間后,以不同的降溫模式降至休眠狀態,轉移到50 L的塑料箱中,每箱2尾魚,每組三個重復,共6尾魚,在一定溫度,一定魚密度,一定鹽度條件下進行試驗,分別記錄存活時間。試驗過程均采用空氣泵充氧,簡易循環水系統加過濾棉凈化海水。

1.2.2.1 不同溫度對石斑魚存活時間影響 將暫養24 h休眠狀態的石斑魚按保活密度為100 g/L加入鹽度為25‰新鮮海水,調節冷庫溫度為13、15、18、20、25 ℃,記錄存活時間。

1.2.2.2 不同保活密度對石斑魚存活時間的影響 將暫養24 h休眠狀態的石斑魚按保活密度為100、133、200、333 g/L分別加入鹽度為25‰的新鮮海水,在水溫為15 ℃條件下進行保活,分別記錄存活時間。

1.2.2.3 不同降溫模式對石斑魚保活時間的影響 取暫養24 h、健康無病的石斑魚，分別采用直接降溫(30 min內降至休眠溫度)、勻速降溫(2 ℃/h)降至休眠狀態、梯度降溫(水溫26～20，3、20～15，2、15～10 ℃，1 ℃/h)、在水溫15 ℃，魚密度為100 g/L條件下進行保活，分別記錄保活時間。

1.2.2.4 不同暫養時間對石斑魚存活時間的影響 取分別暫養0、24、48 h的石斑魚,經低溫誘導休眠后按保活密度為100 g/L條件下進行試驗,在海水鹽度為25‰,水溫為15 ℃條件下進行保活,分別記錄存活時間。

1.2.2.5 不同鹽度對石斑魚存活時間的影響 將暫養48 h休眠狀態的石斑魚按保活密度100 g/L分別加入不同鹽度(15‰、25‰、35‰)的新鮮海水,在水溫為15 ℃條件下進行保活,分別記錄存活時間。

1.2.3 正交試驗 選擇暫養48 h,海水鹽度為25‰,通過不同的保活溫度、保活密度、降溫模式進行三因素三水平正交試驗,如表1所示,以存活時間和水中氨氮濃度作為指標進行單因素方差分析,確定最佳保活條件,并對最佳保活條件進行驗證,分別測定石斑魚在最佳保活條件下的存活時間,水質(pH、電導率、總氨氮含量、非離子氨氮濃度)及血清生理生化指標的變化。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Orthogonal experimental factors and levels design

1.2.4 存活時間 從低溫誘導休眠至死亡前的這段時間記為存活時間,期間每隔4～6 h觀察一次,通過刺激魚體觀察有無反應或者將魚體放入常溫海水中30 min觀察魚鰓蓋是否開閉,判斷魚體是否死亡。

1.2.5 水質指標的分析方法 保活過程水體pH采用pH計監測;電導率儀測定水體電導率;海水中的總氨氮濃度的測定按照GB3097-1997《中華人民共和國海水水質標準》[10],采用納氏試劑法測定。非離子氨氮采用計算法[11]。

1.2.6 血液生化指標的測定 將魚體從保活箱中快速撈起,投入到濃度為200 mg/L的MS-222麻醉液中,麻醉后用10 mL的一次性無菌注射器(預先用質量百分比1%肝素鈉溶液浸潤內壁和針頭)尾動脈抽血,抽血后注入到肝素鈉抗凝的采血管中,緩慢搖晃均勻,4 ℃下3000 r/min離心20 min,取其血清,乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)均采用試劑盒測定;皮質醇含量用酶聯免疫法測定;采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測血清中葡萄糖(GLU)的含量。

1.3 數據處理

使用 SPSS 19.0 軟件對實驗結果進行分析,在單因素方差分析(ANOVA)的基礎上采用最小極差法(LSD)進行組間比較,取p<0.05 為差異顯著,利用Excel 2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響

由圖1可以看出,石斑魚在溫度為13 ℃條件下存活時間低于24 h;在15～25 ℃之間,隨著保活溫度的上升,存活時間下降,在15 ℃時存活時間最長達到128 h,且15、18、20 ℃組間存活時間無顯著差異(p>0.05);在25 ℃時存活時間降至85 h。溫度是活魚運輸的重要影響因素之一,適當的低溫環境可減少魚體的耗氧量、降低其新陳代謝、減輕水質惡化、提高成活率、延長存活時間[8,12]。但溫度過高不利于石斑魚的生存,原因是溫度過高會使低溫休眠后的石斑魚代謝紊亂,溫度過低會影響部分與其生命活動相關的酶的活性,進而影響存活時間。因此15～20 ℃是適合珍珠龍膽石斑魚的保活溫度。Golombieski 等[13]研究發現在15 ℃條件下運輸銀鯰魚的存活率明顯高于20 ℃和25 ℃下的,與本研究結果相似。

圖1 不同保活溫度對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響Fig.1 Effect of preservation temperature on the srvival time of grouper注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖5同。

2.2 不同保活密度對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響

由圖2可以看出,珍珠龍膽石斑魚的成活率隨保活密度的減小而增大,與張麗[14]對大黃魚保活運輸及冰鮮的研究結果一致。在保活密度為333 g/L存活時間顯著下降至最低60 h,保活密度在100、133、200 g/L下存活時間無顯著差異,但在100 g/L保活密度下存活時間最長,達到112 h,原因是保活密度較小的情況下可以減緩魚類的應激反應,防止因代謝紊亂而死亡,同時能夠達到稀釋水中氨氮濃度的作用,防止魚體氨氮中毒,進而達到延長存活時間的效果。因此100～200 g/L保活密度適合珍珠龍膽石斑魚的保活運輸。

圖2 不同保活密度對珍珠龍膽石斑存活時間的影響Fig.2 Effect of preservation densityon the survival time of grouper

2.3 不同降溫模式對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響

由圖3可以看出，采用直接降溫模式的石斑魚保活時間最短，僅有52 h，而勻速將溫模式和梯度降溫模式可長達130 h以上，且無顯著性差異。原因是溫度的劇烈變化直接影響機體的代謝活動，間接支配著魚體的生活和生存[12]。采用梯度降溫與勻速降溫模式的兩組保活時間相差不大，是因為水溫的緩慢變化使魚體有一個適應的過程，不至于代謝紊亂，進而延長存活時間。

圖3 不同降溫模式對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響Fig.3 Effect of different cooling modeson the survival time of pearl gentian grouper

2.4 不同暫養時間對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響

由圖4可以看出,石斑魚的存活時間隨暫養時間的延長而延長,暫養0 h條件下存活時間顯著低于暫養48 h。暫養24、48 h組間無顯著差異,但暫養48 h后的存活時間達到最大值132 h。原因是通過暫養可使魚體內的代謝廢物大幅度減少,從而減緩水質的惡化,而且可以緩解魚體應激反應,延長存活時間[3]。暫養24～48 h的石斑魚存活時間延長至96～132 h,存活96 h前水體較為清澈,但96 h之后,魚體分泌蛋白粘液增多,水體中泡沫增加,影響魚的呼吸。因此暫養24～48 h適合珍珠龍膽石斑魚的保活研究。Berka[15]認為,活魚運輸前應停食1 d以上,運輸時間可提高1倍。劉淇等[16]研究暫養時間對牙鲆無水保活時間的影響,結果表明不經暫養的牙鲆保活時間僅有32 h,而暫養48 h后,保活時間可提高到64 h。

圖4 不同暫養時間對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響Fig.4 Effect of holding time on the survival time of grouper

2.5 不同鹽度對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響

由圖5可以看出,珍珠龍膽石斑魚在鹽度25‰的水體中存活時間最長,達到132 h,而在15‰,35‰鹽度的水體中存活時間均顯著降低(p<0.05)。這與魚類的適應環境能力有關,珍珠龍膽石斑魚適應鹽度范圍為11‰～41‰,最適生長鹽度范圍為25‰～35‰,低于5‰出現死亡[17]。當水體鹽度低于25‰或高于35‰時,魚體受到脅迫產生應激反應,導致存活能力下降。因此,珍珠龍膽石斑魚保活運輸的最適水體鹽度為25‰。研究發現鯉魚使用含9 g/L NaCl的水運輸可明顯提高運輸存活率[18],大量研究表明在運輸水中適當添加鹽有利于淡水魚運輸[19-20];但Gomes等[21]研究發現巨舌滑魚幼魚在塑料袋包裝運輸時添加NaCl不僅沒有減少應激還導致滲透壓調節障礙。因此改變水體鹽度的運輸方法并不適合海水魚類運輸。

圖5 不同鹽度對珍珠龍膽石斑魚存活時間的影響Fig.5 Effect of different salinity on the survival time of grouper

2.6 正交試驗結果

通過正交試驗以存活時間作單因素方差分析可知(見表3),保活溫度與保活密度對存活時間具有顯著性影響(p<0.05),而降溫模式對存活時間無顯著性影響(p>0.05)。對存活時間的影響A(保活溫度)>B(保活密度)>C(降溫模式),根據均值(見表4)確定最佳水平為:A1B1C2,即:保活溫度15 ℃,保活密度100 g/L,降溫模式為梯度降溫。

表2 正交試驗表設計與實驗結果Table 2 Design of orthogonal experimental table and experimental results

表3 方差分析表(因變量:存活時間)Table 3 ANOVA table(dependent variable:survival time of grouper)

表4 存活時間的因素統計表Table 4 Estimates of factors for survival time of grouper

通過正交實驗以水中總氨氮濃度單因素方差分析可知(見表5),保活溫度、保活密度與降溫模式對保活水體總氨氮濃度均具有顯著性影響(p<0.05)。對保活水體總氨氮濃度的影響A(保活溫度)>B(保活密度)>C(降溫模式)。根據均值(見表6)確定最佳水平為:A1B1C2,即:保活溫度15 ℃,保活密度100 g/L,降溫模式為梯度降溫。

表5 方差分析表(因變量:總氨氮濃度)Table 5 ANOVA table(dependent variable:Total ammonia nitrogen concentration of water)

表6 總氨氮含量的因素統計表Table 6 Estimates of factors for total ammonia nitrogen content of water

綜合存活時間和總氨氮濃度的單因素方差分析結果,以及各因素間的顯著性關系,選擇條件為A(保活溫度)15 ℃,B(保活密度)100 g/L,C(降溫模式)梯度降溫進行后續實驗。

2.7 最佳條件的驗證實驗

對正交試驗結果進行驗證,珍珠龍膽石斑魚經過梯度降溫降至休眠狀態,轉移到15 ℃,保活密度為100 g/L條件下進行保活試驗,保活過程中采用充空氣(100 L/min)、過濾循環水(1100 L/h)。記錄存活時間,結果表明:該條件下石斑魚存活時間可達(168±8) h,保活72 h后水中總氨氮含量為(7.28±0.06) mg/L。

2.8 珍珠龍膽石斑魚低溫有水保活過程中水質指標的變化

由圖6可以看出,在低溫有水保活過程中,水體的pH在前24 h內略有降低,在保活48 h時,pH達到最低點,隨后pH持續升高最終趨于穩定,但在0～96 h內水體pH無顯著性變化(p<0.05),這與梁養賢[22]模擬草魚長途運輸的研究結果相似。國家漁業水質標準規定,海水魚的水質pH應控制在 7.0～8.5[23],因此該保活條件下水質pH的變化對石斑魚存活時間影響不大。水體的電導率隨保活時間的延長呈增加趨勢,在0～96 h內增長緩慢,且無顯著性差異,表明珍珠龍膽石斑魚在保活過程中由于代謝產物的積累造成水中鹽類物質含量增加,從而電導率升高。

圖6 水體pH、電導率、總氨氮濃度和非離子氨氮濃度隨珍珠龍膽石斑魚保活時間的變化Fig.6 The changes of water pH,conductivity,total ammonia nitrogen concentration and non-ionic ammonia nitrog en concentration with the survival time of the pearl gentian grouper

水體總氨氮隨保活時間的延長而顯著上升,在0～48 h內水體總氨氮濃度增加緩慢,由于總氨氮濃度的積累,在保活48～96 h范圍內水體總氨氮濃度上升迅速,在72、96 h分別達到7.28、10.31 mg/L。水體總氨氮濃度是影響石斑魚存活時間的主要因素之一,水體總氨氮濃度的增加,導致魚體的存活時間減短[24]。溫度為15 ℃、保活密度為100 g/L條件下氨氮濃度增長緩慢,由此可見低溫可以降低魚體的代謝活動,從而降低水中氨氮濃度,有利于延長存活時間。非離子氨氮濃度在0～48 h無顯著變化,48 h后顯著上升(p<0.05)。氨氮具有神經毒性,會引起魚類在運輸過程中驚厥、昏迷甚至死亡[25]。本研究中,珍珠龍膽石斑魚保活96 h后水體非離子氨氮濃度為0.19 mg/L,遠超出《海水水質標準》(GB 3097-1997)中的0.02 mg/L,表明珍珠龍膽石斑魚在保活過程中能夠耐受短時高濃度的非離子氨氮。

2.9 珍珠龍膽石斑魚低溫有水保活過程中血清生化指標的變化

魚類的血清學指標是測定其健康狀況、營養水平、疾病預防等方面的重要參考依據[26]。珍珠龍膽石斑魚經過低溫有水保活不同時間后血清生化指標的變化見表7,血清中的總蛋白(TP)主要包括白蛋白(Alb)和球蛋白(Glb),白蛋白主要由肝臟合成,有維持血漿滲透壓、參與機體免疫、運輸、營養等功能,球蛋白由淋巴細胞轉化成的漿細胞分泌形成的,在機體的特異性免疫中發揮重要作用,血清總蛋白和白蛋白檢測大都可以反映慢性肝損害及肝實質細胞的儲備功能。由表7可以看出石斑魚在保活過程中血清生化指標中的白蛋白在72 h內變化無顯著性差異(p>0.05);TP在0～72 h內呈現先下降后上升的波動狀態,在保活24 h后有顯著降低,48～72 h逐漸上升,72 h時顯著高于0 h(p<0.05),與白艷龍[9]對黃顙魚無水保活技術研究的結果一致,說明珍珠龍膽石斑魚在低溫保活過程中機體免疫水平受到應激作用先下降后逐漸恢復,并在72 h后達到新的水平。通過機體特異性免疫免疫作用抵抗機體在保活過程中的低溫、饑餓及水質惡化等多因素的應激作用。

表7 珍珠龍膽石斑魚保活不同時間后血清生化指標的變化Table 7 Changes in serum biochemical indicators after different keeping alive time of grouper

皮質醇是應激反應系統中,最后分泌的一種激素,皮質醇的分泌能釋放氨基酸、葡萄糖以及脂肪酸,這些被輸送帶血液里充當能量使用,同時皮質醇能促進糖的合成和脂肪的降解,這些過程產生的能量可以供給機體抵抗饑餓和水質惡化的脅迫,增加機體獲得生存的機會[24],皮質醇、血糖常被作為應激反應的敏感指標,可以反映魚類應激反應的強弱。Zhao[27]等在大口鱸魚的運輸研究中表明低溫能顯著降低水體的總氨氮含量與血清皮質醇含量,降低魚體的應激反應。珍珠龍膽石斑魚在低溫有水保活48 h內血清皮質醇濃度顯著下降,而72 h后恢復至保活前水平,表明在該條件下能有效降低魚體的應激反應。應激反應是一種耗能過程,會導致血糖水平的變化,因此血糖水平常被作為可靠的生理應激指標之一。一些研究表明冷應激會導致魚體血糖水平急劇升高。血糖(Glu)作為主要的能源物質,由表7可以看出珍珠龍膽石斑魚在保活過程中血糖濃度上升,在48 h顯著高于保活前水平(p<0.05),這與尤宏爭[28]的研究結果相似,原因是由于饑餓脅迫或環境應激導致魚體代謝活動增強,所需能量增多,肝糖原分解加速使血糖含量增加[23]。

甘油三酯(TG)的主要功能是供能與儲存能源,還可以固定和保護內臟,其合成的原料之一是脂肪組織。由表7可以看出石斑魚在保活72 h內,血清中甘油三酯的含量無顯著性差異(p>0.05),72 h后其含量略高于初始值,表明脂肪在緩慢代謝。

血清尿素氮(BUN)是機體內蛋白質代謝的最終產物,主要經腎臟從尿液中排泄,腎臟受到損失,血尿素的含量會增加,因而尿素可以作為腎臟功能的評價指標之一[9]。該條件下石斑魚在保活72 h內BUN與初始值相比無顯著性差異(p>0.05),說明在該條件下的保活過程中魚體的腎臟并未受到損傷。

谷丙轉氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)是參與機體蛋白質代謝的酶,當機體各組織器官或病變時,就會把其中的ALT釋放到血液中,使血清ALT含量增加[29]。AST是肝臟中連接糖、脂質、蛋白質代謝的重要酶,正常情況下血清 AST 活性很低而且相對穩定,是肝臟病變程度的重要指標,正常情況下這些血清酶活性較低且相對恒定,當肝臟受到損傷時血清 AST 活性會升高[30]。由表7可以看出,石斑魚在保活24 h后ALT含量顯著高于初始值,48 h時達到最大值,48 h和72 h時都顯著高于初始值(p<0.05),且兩者之間無顯著性差異,AST含量在石斑魚保活24 h時有所降低,隨后逐漸升高,48 h時達到最大值,72 h時略有降低,它們之間均無顯著性差異(p>0.05)。這表明在保活過程中低溫和饑餓的脅迫作用使魚體的肝臟有所損傷。

乳酸脫氫酶(LDH)是糖代謝中催化丙酮酸向乳酸轉化的酶,是心肌梗代謝情況的主要指標酶之一。心肌梗死、肌肉損傷都會導致 LDH 的升高[23]。由表7可以看出石斑魚在保活24 h時LDH含量顯著降低,隨后增長至穩定水平,且與初始值無顯著性差異(p>0.05),這說明該條件下石斑魚進行有氧呼吸且肌肉未損傷,心肌功能正常。

3 結論

珍珠龍膽石斑魚暫養48 h后,采用平均1～2 ℃/h的梯度降溫模式降到休眠狀態,在水溫15 ℃、保活密度100 g/L、鹽度25%的條件下保活,存活時間可達(168±8) h;隨著保活時間的延長,水質總氨氮濃度逐漸增加,保活72 h后水體總氨氮濃度為(7.28±0.06) mg/L,pH無顯著變化,電導率隨時間延長而增加但無顯著變化。血糖在保活過程中顯著上升,而血清皮質醇濃度在72 h恢復到正常水平,白蛋白與甘油三酯無顯著變化,總蛋白與尿素氮在72 h后恢復正常水平。AST和LDH無顯著變化,ALT顯著上升,表明魚體在低溫保活過程中由于環境脅迫導致血清生化指標發生變化,但在72 h內機體能通過代謝酶的調節達到新的平衡狀態。對珍珠龍膽石斑魚在保活運輸過程中的應激與代謝變化還有待進一步深入研究。