國槐潰瘍病致病菌磚紅鐮刀菌毒素的寄主專化性研究

李良壯 劉南南 袁鳳英 王桂清

摘要：磚紅鐮刀菌為國槐潰瘍病致病菌之一，深入研究磚紅鐮刀菌的致病機理及其毒素在致病過程中的作用具有重要意義。采用毒素浸種法，考察磚紅鐮刀菌毒素對國槐和其他19種植物種子萌發及根系生長的影響。結果表明：國槐種子的發芽勢和發芽率隨毒素濃度的增大而降低，即兩者負相關；19種植物種子經毒素處理后，種子萌發和幼苗根系生長或被促進、或被抑制、或不受影響，即表現出多樣性，說明磚紅鐮刀菌毒素為非寄主專化性毒素。該研究為國槐抗病品種選育和病害綜合防控提供了新策略。

關鍵詞：國槐；潰瘍病；磚紅鐮刀菌；毒素；寄主專化性

中圖分類號：S792.26；Q934.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2018）04-0015-04

國槐作為中國的原產樹種，在園林綠化和藥用油用、工業染料等領域發揮著重要作用，但病蟲害的發生降低了其生態價值、經濟價值和藥用價值。國槐潰瘍病是槐樹苗期普遍發生的病害，主要由鐮刀菌（Fusarium）和小穴殼菌（Dothiorella）引起。病原菌分泌產生的毒素被認為是與病程密切相關的一類致病因子，研究植物病原真菌毒素及其作用機理，對于了解植物與病原菌的互作機制具有十分重要的意義。聊城大學植物病理研究室從國槐苗期潰瘍病株中分離鑒定到3種鐮刀菌，分別為磚紅鐮刀菌（F. lateritium）、厚垣鐮刀菌（F. chlamydosporum）和多隔鐮刀菌（F. decemcellular）。本課題采用毒素浸種的方法，測定磚紅鐮刀菌毒素對國槐和其他19種不同植物種子及幼苗根系生理指標的影響，明確磚紅鐮刀菌毒素的寄主專化性類型，為深入研究磚紅鐮刀菌的致病機理和該病菌與國槐互作機制奠定了理論基礎，也為植物的抗病品種選育和國槐潰瘍病的防控提供了新策略。

1 材料與方法

1.1 供試菌種及培養

磚紅鐮刀菌，由聊城大學植物病理研究室提供。接種于PDA培養基，置于25±1 ℃的恒溫培養箱內培養5 d，用打孔器制取0.7 cm的菌餅，備用。

1.2 毒素的制備與提取

將菌餅接入到已滅菌的100 mL PD培養液中，每瓶10個菌片。于25±1 ℃振蕩培養7 d，真空抽濾，濾液于60±1 ℃條件下旋轉蒸發濃縮，直到冷凝管中無水下滴為止，得到毒素粗提取物。

毒素提取原液用無菌三重水稀釋，配制成系列濃度，即終濃度分別為0.100，0.033，0.020，0.014，0.011 g/mL，用于生物活性測定。

1.3 毒素生物活性的測定

1.3.1 供試種子 包括空心菜、白菜、莧菜、油菜、黃瓜、南瓜、西瓜、豆角、蕓豆、黑豆、玉米、小麥、秋葵、番茄、辣椒、胡蘿卜、三葉草、五彩石竹、向日葵、國槐等20種植物種子，購自聊城蔬菜花卉種子市場。

1.3.2 最適毒素濃度的選擇 以國槐種子為材料，采用毒素浸種的方法，比較不同毒素濃度對種子萌發的影響，確定測定毒素生物活性的最適濃度。挑選大小均勻完整的種子，用2% NaClO溶液消毒3～5 min。分別用不同濃度的粗毒素浸泡24 h，以清水浸泡作對照，每個處理30粒種子，3次重復。將浸泡后的種子擺放在鋪有2層濾紙的培養皿中，于25±1 ℃，RH 95%條件下保濕培養。觀察7 d，記錄種子萌發數，按照公式計算發芽率、發芽勢及抑制率。

發芽勢=■×100%

發芽率=■×100%

抑制勢=■×100%

1.3.3 毒素專化性的測定 在最適毒素濃度下，采用浸種法，以19種不同植物種子為靶標，采用上述毒素處理方法，觀察5 d，記錄種子萌發數，計算發芽勢、發芽率及抑制率；并采用Epson Perfection V700 Photo型根系掃描儀測定胚根長度、胚根投影面積等。

1.4 數據處理

利用Excel軟件進行數據統計整理，經DPSv7.05統計軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 磚紅鐮刀菌毒素對國槐種子萌發的影響

國槐種子經不同濃度磚紅鐮刀菌毒素處理后的萌發情況見表1。

由表1可知：不同濃度的毒素處理對國槐種子的萌發具有顯著影響，其發芽率、發芽勢均隨毒素濃度的降低而提高，即與毒素濃度呈負相關。當毒素濃度為0.100 g/mL時，國槐種子的發芽勢與發芽率均為0，抑制率達100.00%；當濃度為0.020～0.033 g/mL時，發芽勢抑制率為76.8%～92.25%，發芽率抑制率為58.67%～84.48%，均超過了50.00%；當濃度低于0.014 g/mL時，發芽勢和發芽率的抑制率均低于50.00%。

毒素濃度過高，寄主種子全部不萌發；毒素濃度過低，寄主種子絕大多數萌發，顯示不出差異。為了使毒素處理后的寄主種子的生理指標變化均有可比性，選擇毒素濃度為0.020 g/mL進行專化性測定，當毒素濃度為0.020 g/mL時，發芽勢和發芽率的抑制率均略超過50.00%，既不過高也不過低。

2.2 磚紅鐮刀菌毒素的專化性研究

2.2.1 磚紅鐮刀菌對19種植物種子萌發的影響 采用浸種法，用濃度為0.020 g/mL的毒素處理19種植物種子，不同種子的萌發情況見表2。

由表2可知：磚紅鐮刀菌毒素對19種植物種子萌發指標的影響表現出多樣化。1） 對不同科植物種子萌發的影響趨勢不同。對豆科、葫蘆科、錦葵科、石竹科和菊科植物種子的發芽勢和發芽率均表現為抑制作用，發芽勢抑制率為3.80%～58.49%，發芽率抑制率為3.66%～39.16%。2） 對同科不同種的植物種子萌發趨勢的影響也不同。用毒素處理十字花科的莧菜、白菜、油菜和空心菜等4種植物，對莧菜種子的發芽勢表現為抑制作用，抑制率為6.71%；而對白菜、油菜和空心菜種子的發芽勢則表現出促進作用，促進率為2.27%～15.46%。3） 對同種植物種子的不同萌發指標影響不同。對玉米種子的發芽勢和發芽率均表現為抑制作用，抑制率分別為50.00%和25.29%；對白菜種子的發芽勢和發芽率均表現為促進作用，促進率均為3.45%；對辣椒種子的發芽勢表現為抑制作用，抑制率為3.40%，而對其發芽率則表現為促進作用，促進率為4.00%；對空心菜種子的發芽勢表現為促進作用，促進率為15.46%，而對其發芽率則表現為抑制作用，抑制率為25.54%；對莧菜種子的發芽勢表現為抑制作用，抑制率為6.71%，而對其發芽率無影響；對小麥種子的發芽勢無影響，而對其發芽率表現為促進作用，促進率為1.12%。

2.2.2 磚紅鐮刀菌對19種植物幼苗根系的影響 磚紅鐮刀菌毒素對19種不同植物幼苗根系指標的影響見表3。

由表3可知：1） 磚紅鐮刀菌毒素對不同科的植物幼苗根系生長影響不同。對葫蘆科、豆科、錦葵科、茄科和石竹科植物幼苗根系生長均表現為抑制作用，總根投影面積的抑制率為0～88.33%，胚根長度的抑制率為0.47%～42.86%；對十字花科、菊科和禾本科植物幼苗根系生長多表現為促進作用，總根投影面積的促進率為2.25%～20.46%，胚根長度的促進率為9.08%～55.11%。2） 對同科不同種的植物幼苗根系生長影響也不同。用毒素處理十字花科的莧菜、白菜、油菜和空心菜等4種植物，對空心菜幼苗的總根投影面積和胚根長度均表現為抑制作用，抑制率分別為2.36%和4.43%；而對莧菜和白菜幼苗的總根投影面積和胚根長度則表現為促進作用，促進率分別為13.42%～17.19%和9.08%～55.11%。3） 對同種植物的不同根系生長指標影響不同。對向日葵和玉米種子的胚根長度表現為抑制作用，抑制率分別為3.73%和11.61%；而對其總根投影面積表現為促進作用，促進率分別為20.46%和2.25%。

3 結論與討論

選用PD培養液，采取濃縮浸提法，提取得到國槐潰瘍病致病菌磚紅鐮刀菌粗毒素；采取毒素浸種法，測定磚紅鐮刀菌毒素對國槐及其他19種植物種子萌發和幼苗根系生長的影響。結果表明，國槐種子的發芽勢和發芽率隨毒素濃度的增大而降低，即兩者負相關；19種植物種子經毒素處理后，種子萌發和幼苗根系生長或被促進、或被抑制、或無影響，即磚紅鐮刀菌毒素對不同植物種子萌發和幼苗根系生長的影響不同，表現出多樣性，說明磚紅鐮刀菌毒素為非寄主專化性毒素。宋以星等人研究表明，經尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）毒素處理的大豆種子，隨著培養時間的延長和處理濃度的升高，發芽率下降。本課題研究結果與之相一致。

植物病原真菌毒素根據其對寄主植物特異性作用差異可分為寄主專化性毒素（Host Specific Toxins，HST）和非寄主專化性毒素（Non-Host Specific Toxins，NHST）。寄主專化性毒素是直接決定植物病原真菌致病性的重要因素，對其寄主植物種類或者栽培品種具有特異性生理活性和高度專化性作用，鏈格孢屬（Alternaria）、長蠕孢屬（Helminthosporium）和鐮刀菌屬（Fusarium）等多種真菌均能產生寄主專化性毒素。鐮刀菌是侵染多種農作物和經濟作物的重要病原菌，其分泌產生的毒素可造成植物萎蔫、根腐、穗腐等腐爛病，導致作物品質下降和嚴重減產。鐮刀菌屬產生的毒素種類很多，其中主要是玉米赤霉烯酮、單端孢霉毒素、串珠鐮刀菌素和伏馬菌素等。

植物病原真菌毒素在植物病害的發生過程中起著重要作用，對寄主的破壞作用首先表現為影響細胞質膜系統，使電解質滲漏增加，當細胞遭受病原真菌傷害時，毒素即與細胞質膜的一種蛋白質結合，使膜結構發生變化、膜的細胞改變、電解質外漏、電導值增加。寄主的抗病性不同，對真菌毒素的耐受力也不同，抗病品種具有使體內病原真菌毒素降解的特性。植物病原真菌毒素尤其是非寄主專化性毒素，對寄主植物的作用強度與品種抗性有關，因此可廣泛應用于誘變育種和選育抗病品種。

目前關于國槐致病菌毒素的研究較少，本課題僅對致病菌之一的磚紅鐮刀菌毒素的寄主專化性進行了初步研究，將進一步開展國槐病害致病菌毒素的結構、種類及數量在病菌侵染國槐時起到的作用及機制與國槐抗性的關系等研究，明確國槐病害的致病機理，為其抗病品種選育和綜合防控提供新策略。

參考文獻

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