高粱種子萌發期耐鹽材料的篩選與鑒定

王春語，張麗霞，王 平，叢 玲，于惠琳，黃瑞冬

(1.遼寧省農業科學院創新中心，遼寧沈陽 110161;2.遼寧省農業科學院玉米研究所，遼寧沈陽 110161;3.沈陽農業大學農學院，遼寧 沈陽 110866)

【前人研究進展】由于不合理的開荒種地和大 力發展灌溉農業，全世界鹽堿化土地面積逐年增加。如何利用和改良鹽堿化土地，如何篩選、培育出耐鹽堿能力強的品種是解決這一問題的主要途徑。全世界大批專家學者致力于植物耐鹽堿研究領域，且在擬南芥［1］、水稻［2］、玉米［3］、小麥［4］和谷子［5］等植物中已經開展了深入的研究。高粱具有極強的耐鹽堿、耐旱和耐貧瘠能力，高粱也是糧食、飼料、釀造等多種用途的作物，且高梁基因組較小(約730 Mb)，被認為是研究耐鹽堿特性的重要模式作物［6］。由于高粱特殊的研究價值和經濟價值，近年來受到大家越來越多的關注。國內外有關高梁耐鹽性研究的報道也越來越多，甜高粱在鹽脅迫條件下，通過轉錄組高通量測序的方法挖掘到大量與鹽脅迫響應以及糖積累有關的基因［7］。甜高粱在鹽脅迫條件下，耐鹽材料和鹽敏感材料在Na+、Cl－和K+離子積累方面差異較大，SSV84在－1.6MPa鹽脅迫下，不論是種子萌發期還是苗期都表現出很強的耐鹽性，并且鹽敏感甜高粱材料Na+和Cl－離子濃度在莖稈和根中積累的量遠遠高于耐鹽材料;而K+離子的量在耐鹽品種中大量積累，在鹽敏感材料中迅速下降。K+/Na+離子濃度的比值在耐鹽材料中遠高于鹽敏感材料。因此，在篩選、鑒定耐鹽材料時，K+/Na+離子濃度的比值是一個重要的參考指標［8］。其他的學者同時也挖掘到一些與鹽脅迫響應有關的基因以及 QTLs，如 SbHKT1;4、SbVPPase和 P5CS1等［9－12］。到目前為止，有關高粱耐鹽方面的研究主要集中在形態結構、生理指標和和耐鹽基因挖掘等方面，但是系統全面地對高粱耐鹽性的研究并不多。

【研究意義】不同高粱材料和不同生育時期的耐鹽性差異較大，篩選各個時期的耐鹽材料對指導鹽堿地高粱種植、實現高產穩產均具有重要的意義［13－14］。【本研究切入點】萌發期是作物生長的關鍵時期，對作物群體數量和結構具有重要的決定作用。高粱種子萌發期耐鹽材料的篩選、鑒定等相關研究較少，涉及的材料數量以及地域有限，且種子萌發期耐鹽性有效的評價指標也是有待探討的問題。

關于高粱耐鹽材料的篩選、鑒定，前人也有相關的研究報道［15］。張云華等以7個不同高粱品種為試材，對萌發期和苗期的耐鹽性進行鑒定，不同品種間耐鹽性差異較大，并且雜交種的耐鹽性明顯高于親本，并且提出了鹽堿地適宜的方法是培育更加耐鹽的雜交種［14］。高鳳菊等對14個甜高粱品種的種子萌發進行脅迫處理，結果同樣表明雜交品比常規品種耐鹽性強［16］。那么，篩選耐鹽性更強的材料作為雜交親本就顯得更加重要。孫璐等利用150 mM NaCl對42個高粱品種的種子萌發進行脅迫處理，10 d后統計發芽率、根長、葉長、根重、葉重等指標，通過主成分分析、聚類分析和對各品種的表現對不同高粱的耐鹽性進行篩選與鑒定，結果表明150 mM NaCl可以作為高粱種子萌發期耐鹽性篩選鑒定的適宜濃度，并且根長、葉重和發芽率等是非常實用的篩選指標［17］。上述文獻都是關于高粱種子萌發期耐鹽材料的篩選與鑒定等方面的研究，但是篩選的材料數量太少，難以篩選到耐鹽等級很高的材料。【擬解決的關鍵問題】因此，需要擴大篩選材料的數量以及材料來源地域，設置合理有效的篩選指標和方法。

本實驗選用NaCl(模擬鹽脅迫)對供試材料進行鹽脅迫處理，共設立 0%(對照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%11個不同濃度梯度，通過統計出苗率判定耐鹽性的強弱。通過不同濃度梯度NaCl處理粒用高粱BTx623和甜高粱Rio統計出苗率，初步確定高粱種子萌發期適宜的NaCl篩選濃度為1.2%。篩選出來的材料加大選擇壓力進一步篩選，最終獲得種子萌發期耐鹽性強的高粱材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

396份供試材料由國際熱帶半干旱地區作物研究所(ICRISAT)提供的微核心種質191份，中國國家作物種質庫中期庫提供國內農家種189份，遼寧省農業科學院創新中心國家高粱改良中心提供國內常規品種8份以及黑龍江農科院提供的8份國內常規品種。材料涉及中國以及全球不同地區(非洲、亞洲、美洲和北美洲等)、不同類型(甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和國內農家種)的高粱材料。地區的廣泛性和品種的多樣性更有利于篩選到優良的耐鹽材料。

1.2 試驗方法

以粒用高粱BTx623和甜高粱Rio為代表，利用國產MGC-350HP-2型人工氣候箱(上海一恒科學儀器有限公司)，采用 NaCl模擬鹽脅迫，設置0%(CK)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和 2.0%不同濃度梯度處理，確定初步篩選的NaCl濃度。然后以NaCl初篩濃度對收集到的396份高粱材料進行初步篩選，耐鹽能力較強的材料不斷加大選擇壓力，最終篩選出高粱種子萌發期強耐鹽能力的材料。

選取籽粒飽滿、均勻一致且無病蟲害的風干種子100粒，放在墊有三層濾紙的發芽盒中，分別加入等體積的無菌水和不同濃度NaCl處理液，將發芽盒置于人工氣候箱25℃處理5 d(16 h Light/8h Dark)后統計種子的萌發率，7 d后統計種子的出苗率。萌發以種子露白為標準，出苗以2片子葉變綠展開為標準。

相對萌發率=(處理后5 d種子的實際萌發率/對照種子萌發率)×100%

相對出苗率=(處理后7 d種子的實際出苗率/對照種子出苗率)×100%

表1 相對萌發率、相對出苗率統計標準Table 1 The statistical standards of the relative germination rate and relative seedling-emergence rate

試驗重復2～3次，求平均值進行統計，統計標準如表1。

2 結果與分析

2.1 NaCl初步篩選濃度的確定

為了確定適宜的NaCl模擬鹽脅迫的篩選濃度，以粒用高粱BTx623和甜高粱Rio為試驗材料，采用0%(CK)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8% 和 2.0% 不同濃度NaCl處理5 d后統計相對萌發率和7 d后統計相對出苗率。如圖1所示，粒用高粱BTx623和甜高粱Rio在不同濃度NaCl處理下，兩份材料的相對萌發率和相對出苗率變化趨勢一致，即隨著NaCl濃度的增加，相對萌發率和相對出苗率逐漸降低，但兩者之間差異不顯著。當鹽濃度較低時，低鹽脅迫對種子的萌發率影響較低，即使NaCl濃度達到1%時，BTx623和Rio的相對萌發率都達到85%以上。當NaCl濃度達到1.2%時，兩者的相對萌發率明顯下降。當NaCl濃度達到1.4%時，BTx623和 Rio的相對萌發率下降幅度很大。當NaCl濃度達到1.8%時，BTx623和Rio的相對萌發率不足20%。當NaCl濃度達到2.0%時，BTx623和Rio萌發率特別低，甚至不能萌發。如果以相對萌發率作為種子萌發階段的一個篩選指標，NaCl濃度為1.2%時較為適宜。

圖1 NaCl不同濃度梯度處理下，BTx623和Rio相對萌發率和相對出苗率統計Fig.1 Treatment with different concentration of NaCl，statistic of the relative germination rates and relative seedling-emergence rates of BTx623 and Rio

鹽脅迫對種子出苗率的影響遠遠大于對其萌發率的影響。當NaCl濃度在0.8%以下時，BTx623和Rio的相對出苗率都達到85%以上，對出苗率的影響較小，沒有造成嚴重的鹽害。但當NaCl濃度大于1%時，兩者的相對出苗率下降幅度較大。當NaCl濃度達到1.2%時，BTx623和Rio的相對出苗率不足70%。當NaCl濃度達到1.4%時，BTx623和Rio的相對出苗率下降顯著不足60%。當NaCl濃度達到1.6%時，BTx623和Rio的相對出苗率下降幅度更大不足30%。當NaCl濃度達到1.8%時，BTx623和Rio的相對出苗率不足10%;當NaCl濃度達到2%時，BTx623和Rio不能出苗。經過以上的初步實驗，確定大批材料的初步篩選時NaCl濃度為1.2%較為適宜。篩選出較耐鹽的材料不斷增加選擇壓力進一步篩選、鑒定耐鹽能力更強的高粱材料。

2.2 高粱耐鹽材料的篩選

396份高粱材料NaCl濃度為1.2%分別處理5和7 d后，分別統計相對萌發率和相對出苗率。如圖2A所示，相對萌發率達到一級、二級、三級、四級和五級的樣品數分別為119、132、105、39和1份，分別占總樣品比例為 30.05%、33.33%、26.52%、9.85%和0.25%。相對萌發率達到60%以上的材料共有251份，占樣品總數63.38%。如圖2B所示，1.2%NaCl處理7 d后，相對出苗率達到一級、二級、三級、四級和五級的樣品數分別為79、115、130、69和3份，分別占總樣品比例為 19.95%、29.04%、32.83%、17.42%和 0.76%。相對出苗率達到60%以上的材料共有194份，占樣品總數48.99%。進一步證明，低鹽脅迫和中等鹽濃度脅迫對種子出苗率的影響遠遠大于對其萌發率的影響。1.2%NaCl對種子萌發期出苗率有較大的影響，但作為初步篩選壓力仍然篩選出的耐鹽材料較多，需要加大篩選壓力。出苗率的高低才是保證作物群體數量的關鍵，在進一步的篩選過程中我們只關注最終的出苗率。

圖2 1.2%NaCl處理下，396份高粱材料的相對萌發率和相對出苗率統計Fig.2 Treatment with 1.2%NaCl，statistic of the relative germination rates and relative seedling-emergence rates of 396 sorghum materials

圖3 1.4%NaCl處理下，79份高粱材料相對出苗率統計Fig.3 Treatment with 1.4%NaCl，statistic of the relative seedling-emergence rates of 79 sorghum materials

將相對出苗率達到一級的79份材料進行1.4%NaCl處理7 d后，相對出苗率達到一級、二級、三級、四級和五級的樣品數分別為3、15、45、16和0份，分別占總樣品比例為 3.8%、18.99%、56.96%、20.25%和 0%(圖 3A)。1.4%NaCl對出苗率影響很大，出苗率下降顯著。如果篩選樣品數量非常大時，采用NaCl濃度為1.4%能快速有效篩選到抗鹽性較強的材料，減少下一步的篩選工作量。1.4%NaCl屬于較高的篩選濃度，但是為了更進一步驗證實驗結果，我們將篩選壓力不斷增加。當NaCl濃度達到1.4%時，相對出苗率達到60%以上(即一級和二級)的18份材料進行1.8%NaCl處理，處理后相對出苗率達到60% ～79.99%為1份(二級)，40% ～59.99%為4 份(三級)，20% ～39.99%為9份(四級)，0～19.99%為4份(五級)(圖3B)。

當NaCl濃度達到1.6%時，只有5份材料的相對出苗率在40%以上，為了更進一步驗證這5份材料的耐鹽性，繼續加大NaCl篩選壓力，采用1.8%NaCl處理時，結果如表2所示。采用1.8%NaCl處理時，鹽脅迫濃度非常高，兩片子葉能正常變綠但不能完全展開，且生長非常緩慢。當NaCl濃度達到2.0%時，種子很難正常萌發生長，超出高粱的最大耐受能力，所以繼續增加NaCl處理濃度已經沒有實際意義。

表2 5份高粱材料在1.8%NaCl脅迫處理下的相對出苗率統計Table 2 Treatment with 1.8%NaCl，statistic of the relative seedling-emergence rates of 5 sorghum materials

2.3 高粱種子萌發期耐鹽基因定位群體構建

提高高粱種子萌發期出苗率對保障作物群體以及最終產量都具有重要的意義，因此，深入挖掘種子萌發期高粱耐鹽基因迫在眉睫。利用已經篩選出來的種子萌發期耐鹽性最強的5份材料L211、L004、L006、L320和 L293分別和已經測序的粒用高粱BTx623(1.8%NaCl處理下相對出苗率為6.94%±1.28%)雜交構建基因定位的RIL群體，用于挖掘高粱種子萌發期在鹽脅迫下影響出苗率的鹽響應基因。目前正在進行群體構建，基因還未定位。

3 討論

作物耐鹽性是一個非常復雜的過程，因此不同生育時期和不同品種間耐鹽性差異很大，而且沒有一個統一的衡量標準。種子萌發階段，通常篩選指標包括相對萌發勢、相對萌發率、相對萌發指數、相對活力指數、相對根長、相對葉長、相對根鮮重、相對葉鮮重、相對根干重、相對葉干重、各類酶活性檢測等，但是保證出苗率才是保證最終產量的前提，因此出苗率才是種子萌發期耐鹽性強弱的最直接指標，因此，本研究主要以最終的出苗率作為衡量標準。大田只有鹽害的土壤幾乎很少，常常伴隨著不同程度的堿脅迫。實驗室內模擬鹽脅迫處理與大田鹽堿土壤的萌發、出苗環境差異很大，因此實驗室內產生的數據要到大田中重復驗證。大田環境變化多樣，尋找一大塊鹽堿濃度完全一致的試驗田很困難，再加上自然環境(如降雨量的多少)的變化，很難長期保證一塊地一個鹽堿濃度，加大了直接利用大田來篩選大批材料耐鹽堿性的難度。因此，篩選耐鹽材料快捷有效的方法是在實驗室內采取容易控制的環境模擬鹽脅迫處理從大量的試驗材料中篩選出一批耐鹽性較強的材料，然后再到大田中多年多點驗證。另外，不同作物不同生長發育階段的耐鹽性差異較大，種子萌發期耐鹽性強的材料，在后期的苗期、拔節期、抽穗開花期和灌漿期不一定耐鹽，篩選出一批耐鹽性強的材料，還要注意其全生育期的耐鹽性。

高粱種子萌發期選擇多大的NaCl濃度處理較為合適，本實驗采用不同濃度梯度的方式進行篩選確定，最終確定1.2%NaCl為大批材料的初篩濃度。孫璐等對42個高粱材料進行種子萌發期的鹽脅迫處理，實驗結果表明，150 mM NaCl(相當于0.88%)是高粱種子萌發期耐鹽性篩選、鑒定的適宜濃度［17］。本研究采用1.2%NaCl處理，出苗率達到80%以上的材料共有79份，如果濃度降低，出苗率達到80%以上的材料會更多，增加了下一步的篩選壓力。當篩選樣本數很大時，應該適當提高篩選濃度。但是也不能過高，篩選一個耐鹽性強的材料，應該觀察這個材料在不同鹽濃度處理下的出苗率和長勢情況。

高粱有不同的類型，包括甜高粱、粒用高粱、草用高粱和帚用高粱等，本研究所用的396份高粱材料包含了以上幾種不同的類型，但是最終篩選到5份耐鹽性很強的材料都是粒用高粱，即使這樣，也不能斷定粒用高粱的耐鹽性一定高于其他類型的高粱。相比較，到底哪種類型的高粱材料耐鹽性更強，還需要更大的群體數量和其他的指標去衡量。

4 結論

通過設置不同濃度梯度NaCl處理，確定大批材料初步篩選時NaCl濃度為1.2%較為適宜。全球收集的396份高粱材料，經過不斷加大選擇壓力，最終篩選出5份耐鹽能力很強的高粱材料，其中4份來自中國、1份來自美國，且5份都為粒用高粱。

致 謝:對本研究材料的提供方遼寧省農業科學院創新中心國家高粱改良中心、國際熱帶半干旱地區作物研究所、中國國家作物種質庫中期庫和黑龍江省農業科學院表示感謝。材料收集過程中得到了鄒劍秋老師和焦少杰老師的大力支持，在此提出特別感謝。