基于無縫克隆方法構建毛木耳多功能纖維素酶基因農桿菌轉化載體

賈定洪，李小林，周 潔，彭衛紅，譚 偉，黃忠乾，甘炳成

(四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川成都 610066)

【研究意義】纖維素分解為葡萄糖至少需要3種纖維素酶，包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶。而福壽螺(Ampullaria crossean)胃組織分離的纖維素酶基因(multi-functional cellulase gene，Mfc)能夠編碼內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶這三種纖維素酶［1］，是一種多功能纖維素酶，應用前景看好。而毛木耳是一種木腐真菌，其纖維素降解等能力是生物轉化率的酶學基礎，是毛木耳實現高產的重要保證。但是獨立的酶基因無法啟動其自身表達，只有適合于宿主的啟動子、基因及終止子的適當組合，才能夠啟動目標基因表達，考察其對宿主性狀的作用。因此，通過宿主啟動子的克隆、目標基因密碼子優化及終止子的正確組裝，將是實現多功能纖維素酶基因Mfc在毛木耳細胞中表達和改良菌株纖維素降解能力的必要前提。【前人研究進展】目前多功能纖維素酶基因Mfc已在灰蓋鬼傘［2］和草菇［3］等食用菌進行了轉化研究。但Mfc基因來源于福壽螺組織，在毛木耳細胞中不一定能夠穩定高效表達。為了將該基因改造成為具有毛木耳物種偏好性［4］的編碼序列，以免影響基因的蛋白翻譯［5］，前期實驗中賈定洪已將多功能纖維素酶基因Mfc改造為具備毛木耳密碼子偏好性的基因Mfcsg［6］，為該基因在毛木耳細胞中表達奠定了基礎。【本研究切入點】實驗通過毛木耳Gpd啟動子、內含子intron及改造型Mfcsg基因克隆，將之與pPK2質粒EcoRI酶切大片段進行無縫克隆，分別構建農桿菌轉化載體pAKMFC、pAKIMFC，為多功能纖維素酶基因Mfc在毛木耳細胞中轉化表達和種性改良奠定基礎。【擬解決的關鍵問題】組裝形成Mfcsg基因表達盒，構建該基因啟動子、目的基因及終止子轉化質粒，為多功能纖維素酶基因Mfcsg在毛木耳細胞轉化表達提供具有自主知識產權的轉化質粒。

1 材料與方法

1.1 材料與質粒

pPK2質粒購自杭州工道生物技術有限公司。DH5(感受態細胞購自上海超研生物科技有限公司。ClonExpress MultiS多片段無縫克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，其它試劑購自生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉化載體pAKMFC構建 EcoRⅠ酶切質粒pPK2，回收大片段，應用引物對1Fakmfc/1Rakmfc、Mfcfakmfc/Mfcrakmfc、CFakmfc/CRakmfc 分別擴增毛木耳Gpd啟動子、Mfcsg基因、Hpt部分基因(引物見表1)，按照ClonExpress MultiS多片段無縫克隆試劑盒方法一步克隆獲得農桿菌轉化載體pAKMFC［7］。

1.2.2 轉化載體 pAKIMFC構建 EcoRⅠ酶切pPK2質粒，回收大片段，應用引物對 1Fakimfc/1Rakimfc、AFakimfc/ARakimfc、Mfcfakimfc/Mfcrakimfc、CFakimfc/CRakimfc分別擴增毛木耳 Gpd啟動子、intron、Mfcsg基因、Hpt部分基因(引物見表 2)，按照1.2.1方法構建農桿菌轉化載體pAKIMFC。

1.2.3 轉化載體pAKMFC、pAKIMFC測序驗證pAKMFC、pAKIMFC質粒構建后熱激轉化到 DH5(感受態細胞，挑選陽性克隆送生工生物工程上海(股份)有限公司測序，測序引物為 pPK2f(5’-CTAGCCAATACGCAAACCGC-3’)和 pPK2r(5’-CTTAGTAGGAATGATTTTCG-3’)，該引物可以擴增pAKMFC、pAKIMFC改造區DNA序列。

表1 pAKMFC載體構建引物序列表Table 1 Primer sets used for the plasmid construction of pAKMFC

表2 pAKIMFC載體構建引物序列表Table 2 Primer sets used for the plasmid construction of pAKIMFC

圖1 pAKMFC質粒測序驗證圖Fig.1 pAKMFC plasmid validated by sequencing

2 結果與分析

2.1 轉化載體pAKMFC測序驗證

將質粒pAKMFC測序獲得的序列與目標序列比對，發現改造獲得的質粒與目標設計序列完全一致，改造后的質粒中Gpd啟動子、Mfcsg基因、Hpt基因構件完整、準確，達到了實驗預期(圖1)。將測序序列與pPK2質粒大片段拼接后獲得pAKMFC質粒圖譜(圖2)

2.2 轉化載體pAKIMFC測序驗證

將質粒pAKIMFC測序獲得的序列與目標序列比對，發現改造獲得的質粒與目標設計序列完全一致，改造后的質粒中Gpd啟動子、intron、Mfcsg基因、Hpt基因構件完整、準確，達到了實驗預期(圖3)。將測序序列與pPK2質粒大片段拼接后獲得pAKMFC質粒圖譜(圖4)。

3 討論

圖2 pAKMFC質粒圖譜Fig.2 Plasmid profile of pAKMFC

圖4 pAKIMFC質粒圖譜Fig.4 Plasmid profile of pAKIMFC

表達元件的正確組裝是目的基因有效表達的前提。采用合適的啟動子、適合于宿主密碼子偏好性的基因序列及有效終止子，將促進目標基因高效表達。本實驗采用毛木耳Gpd啟動子、具備毛木耳密碼子偏好性的多功能纖維素酶基因、潮霉素B抗性基因及構巢曲霉終止子，構建了較為理想的適合于毛木耳表達的多功能纖維素酶表達盒。實驗共設計構建了2個農桿菌轉化質粒pAKMFC和pAKIMFC，它們之間區別在于pAKIMFC是在pAKMFC的啟動子與表達基因之間插入了一段pPK2質粒原有的內含子GpdA，目的在于考察內含子對于基因表達的影響。實驗構建形成了適合于農桿菌介導轉化毛木耳應用的改造型多功能纖維素酶基因Mfcsg雙元表達質粒pAKMFC和pAKIMFC，并且已成功用農桿菌AGL1::pAKMFC和AGL1::pAKIMFC轉化毛木耳，提高了毛木耳菌絲的吃料能力(結果另文發表)，該研究為農桿菌介導的多功能纖維素酶Mfcsg基因轉化改良毛木耳奠定了基礎。