川西高寒山區野生藥用黃芪根瘤菌的遺傳多樣性

江華明，劉松青，李仁全，彭萬仁，張小平

(1.四川職業技術學院，四川 遂寧 629000;2.成都師范學院，四川成都 611730;3.四川農業大學資源學院，四川 成都 611130)

【研究意義】川西高寒山區是指四川阿壩州、甘孜州區域內海拔1500 m以上的橫斷山區，位于青藏高原東部。該區域氣候冷涼、降雨較少，晝夜溫差大。其中，甘孜州屬青藏高原氣候，年均氣溫在5～10℃之間，年降水量在400～1000 mm之間，具有氣溫低、冬季長、日照足的特點。阿壩州山原地帶為溫涼半濕潤氣候，夏季溫涼，冬春寒冷，干濕季明顯;年平均氣溫5.6～8.9℃，且隨著海拔高度的變化，氣候從亞熱帶到溫帶、寒溫帶、寒帶，呈明顯的垂直性差異。川西高寒山區是青藏高原藥用植物資源的重要分布區。黃芪屬植物約2000多種，廣泛分布于歐洲、亞洲、南美洲及非洲。我國278種，2亞種、35變種、2變型，本屬植物主要用于牲畜飼料、藥用和綠肥［1］。四川約有67種12變種1變型。甘孜州有47種9變種［2］。【前人研究進展】目前對川西高寒山區黃芪根瘤菌資源研究的不多。李瓊芳［3］從四川省甘孜州海拔3650 m的瓦澤鄉和海拔4250 m的折多山的黃花黃芪(Astragalus gilviflorus)和梭果黃芪(Astragalus stii)分離得到33株根瘤菌。采用數值分類和不同的分子生物學方法進行分析結果顯示，33個菌株均屬于 Mesorhizobium。周蜃等［4］對其中一個分支中包含SCAU7，SCAU11，SCAU27的菌株進一步進行共生基因(nodC、nifH)序列分析、DNA同源性分析、細胞脂肪酸組成成分分析，最終確定SCAU7T和SCAU27為新種群，命名為Mesorhizobium sangaii，菌株SCAU7T作為該新種的模式菌株。【本研究切入點】本研究從采集自四川甘孜藏族自治州和阿壩藏族羌族自治州的10種具有一定藥用價值的黃芪植物［1］(膜莢黃芪 Astragalus membranaceus，云南黃芪 A.yunnanensis，長小苞黃芪 A.balfourianus，單蕊黃芪 A.monadelphus，窄翼黃芪 A.degensis，腎行子黃芪 A.skythropos，康定黃芪 A.tatsienensis，厚葉黃芪 A.crassifolius，梭果黃芪 A.ernestil，彎齒黃芪A.camptodontus)的根瘤中分離根瘤菌，測定分離株的耐鹽性、初始pH生長范圍及生長溫度范圍等生理指標，并采用BOXAIR-PCR、16S rDNA PCR-RFLP及16S rDNA序列分析等方法。【擬解決的關鍵問題】揭示該區域野生藥用黃芪根瘤菌的遺傳多樣性，為優良菌株的選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 根瘤樣本的采集 從四川甘孜州康定、道孚、爐霍、甘孜、稻城、雅江等6個縣10個采樣點及四川阿壩州黃龍寺采集到藥用黃芪植物根瘤及土壤樣品，并記錄根瘤的形狀及結瘤部位。

表1 藥用黃芪根瘤菌供試菌株及參比菌株Table 1 Strains isolated from medicinal plants of Astragalus spp.and reference strains

注:R:Rhizobium，M:Mesorhizobium，Ag:Agrobacterium。

1.1.2 藥用黃芪植物根瘤菌的分離和純化 藥用黃芪植物根瘤菌的分離和純化參照Vincent的方法［5］。用無菌水浸泡清洗根瘤，再用75%酒精和0.1%HgCl2分別對根瘤表面消毒5和3 min，用無菌水沖洗3次。在無菌培養皿中磨碎根瘤，取根瘤懸液在YMA平板上劃線，置28℃恒溫箱中培養7～10 d，挑取表面濕潤、光滑、突起、有莢膜多糖產生的單菌落，采用劃線法反復純化，革蘭氏染色鏡檢。陰性純菌株接種于YMA斜面，28℃培養3d，4℃短期保藏，30%甘油管中－80℃長期保藏［6］。分離的供試菌株和參比菌株列表1。

1.2 BOXAIR-PCR 指紋分析

總DNA的提取參照 Little［7］的方法。提取的DNA保存于－20℃備用。BOXAIR-PCR指紋分析中，引物為 BOXAIR:5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’。反應體系(25 μl)為:2 × PCR Mix 12.5 μl;BOXAIR 引物(10 μM)0.5 μl;模板 DNA(50 ng/mL)1.0 μl;雙蒸水11 μl;擴增程序:95 ℃變性4 min;95℃變性1 min，54℃復性1 min，65℃延伸8 min，循環35次;65℃最終延伸11 min。4℃保存。擴增產物經2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳(80 V，2 h)檢測，凝膠UV成像系統成像，以JPG形式保存［6］。

1.3 16S rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析

以總DNA為模板，選用來源于大腸桿菌16S rDNA基因序列保守區域的兩段引物P1和P6來擴增16SrDNA。正向引物P1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’。其序列對應于 E.coli第8-37堿基位置;反向引物P6:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’。其序列對應于E.coli第1479～1506堿基位置。擴增16SrDNA和酶切反應體系反應體系請參見文獻［6］。

1.4 供試菌株16S rDNA序列測定及系統發育分析

擴增全部35株供試菌株的16S rDNA片段(反應體系和程序同1.3)，擴增產物(1500 bp)經檢測后送北京華大基因有限公司測定序列。

1.5 菌株生理特性分析

對35株根瘤菌分別進行耐鹽性、初始pH生長范圍及生長溫度范圍的測定［6］。

1.6 數據分析和處理

采用Nei等［8］的方法計算材料間遺傳相似系數(GS)，GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中，Ni代表第 i個品種的擴增帶紋數目，Nj代表第j個品種的擴增帶紋數目，Nij代表第i、j個品種間共有的帶紋數目。通過NTSYS2.10e軟件中的基于非加權成對算術平均法(UPGMA)進行聚類分析，并轉化為樹狀圖譜;利用NTSYS-pc(Version 2.10e)軟件進行GS相似性系數分析，并通過EIGEN程序進行主成分分析;將所測供試菌株16S rDNA序列提交GenBank數據庫，獲取序列號(表1)。采用 Blast search在線分析及DNAMAN6.0軟件進行序列比對，找出各序列在NCBI數據庫中最近緣種的模式菌株序列，再用MEGA 5.0中的Clustal X程序進行多序列比對，用Neighbor-Joining方法選擇Bootstrap為1000個重復構建系統發育學進化樹［6］。

2 結果與分析

2.1 藥用黃芪根瘤菌分離及BOXAIR-PCR指紋分析

從10種藥用黃芪(膜莢黃芪Astragalus membranaceus，云南黃芪 A.yunnanensis，長小苞黃芪 A.balfourianus，單蕊黃芪 A.monadelphus，窄翼黃芪 A.degensis，腎 行 子 黃 芪 A.skythropos，康 定 黃 芪 A.tatsienensis，厚葉黃芪 A.crassifolius，梭果黃芪 A.ernestil，彎齒黃芪A.camptodontus)的根瘤中分離得了35個根瘤菌菌株作為供試菌株，另外，選取了屬于 Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Agrobacterium的參比菌株14個(表1)。對這些菌株開展了系列研究。

以各菌株總DNA為模板，BOXAIR為引物，對35株供試藥用黃芪植物根瘤菌進行BOXAIR-PCR，在2%瓊脂糖凝膠電泳板上得到BOXAIR-PCR指紋圖譜(圖1)。

在相似系數84.6%的水平，35個藥用黃芪供試菌株和14個參比菌株中，除6個供試菌株單獨分開(SCAU 609;SCAU487;SCAU596;SCAU491;SCAU549;SCAU550)外，其余菌株聚成6個遺傳群(圖2)。

將采用UPGMA法進行聚類分析的結果轉換為協表征矩陣，對協表征矩陣和相似系數矩陣的相關性進行Mantel檢驗。結果表明，2種矩陣顯著相關，相關系數 r=0.853，P=0.005，說明聚類結果能較準確地反映菌株之間的遺傳關系。

圖1 藥用黃芪根瘤菌部分菌株BOXAIR-PCR指紋圖譜Fig.1 BOXAIR-PCR figureprints of the strains isolated from medicinal plants of Astragalus sp.

圖2 藥用黃芪根瘤菌BOXAIR-PCR聚類分析圖Fig.2 Dendrogram based on BOXAIR-PCR fingerprints of the strains tested

2.2 16S rDNA PCR-RFLP聚類分析和主成分分析(PCA)

2.2.1 PCR-RFLP聚類分析 由圖3可知，以P1和P6為引物對49個菌株(35個供試菌株和14個參比菌株)的16S rDNA進行特異性擴增，分別用Hae III、Msp I、Hinf I和 Taq I對擴增的 1.5 kb 片段進行酶切，2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳形成圖譜。

對49個菌株的16S rDNA擴增產物的酶切條帶利用UPGMA進行聚類分析并生成樹狀圖譜。

在相似系數83%的水平上，所有供試菌株均與參比菌株完全分開。在供試菌株中，SCAU549、SCAU568、SCAU596單獨分開，其余菌株聚成4個遺傳群。

圖3 藥用黃芪根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP聚類Fig.3 Dendrogram based on 16S rDNA PCR-RFLP of the tested strains

圖4 藥用黃芪根瘤菌及參比菌株16S rDNA PCR-RFLP主成分分析三維圖Fig.4 3-d PCA for 16S rDNA PCR-RFLP of strains isolated from medicinal plants of Astragalus and reference strains

將采用UPGMA法進行聚類分析的結果轉換為協表征矩陣，對協表征矩陣和相似系數矩陣的相關性進行Mantel檢驗。結果表明，2種矩陣顯著相關，相關系數 r=0.835，P=0.005，說明聚類結果能較準確地反映菌株之間的遺傳關系。

35個供試菌株4種酶酶切后共形成27種基因型，通過Simpson指數公式D=1－ΣPi2(Pi為16S rDNA某基因型個體數占總個體數的比例，即第i個等位基因變異出現的頻率)計算出35株藥用黃芪根瘤菌遺傳多樣性指數D=0.916，表明該地區藥用黃芪根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性。

2.2.2 主成分分析 應用 NTSYS-pc(Versin 2.10e)軟件對49個菌株(斜莖黃芪35個供試菌株和14個參比菌株)16S rDNA-PCR的相似系數進行主成分分析，用EIGEN程序作主成分之間的三維關系圖(圖4)，前3個主成分所能解釋的相關性分別為28.82%、16.54%和14.45%。主成分分析與16S rDNAPCR聚類結果基本一致:26.SCAU568單獨分開。群I:6.SCAU480，7.SCAU487，8.SCAU489;14.SCAU533;15.SCAU534;16.SCAU536;17.SCAU540;18.SCAU542;34.SCAU 609;24.SCAU550;25.SCAU551;27.SCAU591;33.SCAU597;群 II:30.SCAU 594;32.SCAU596;31.SCAU595;21.SCAU545;22.CAU546;群IV:1.SCAU470;2.SCAU471;3.SCAU472;4.SCAU473;5.SCAU474;群 V:11.SCAU516;12.SCAU517;13.SCAU519;群 VI:9.SCAU490;10.SCAU491;23.SCAU549。群 VII:19.SCAU543;22.SCAU546;45:R.etli CFN42。而35.SCAU611 與中慢生參比菌株 41:M.temperatum SDW 018T、42:M.tianshanense CCBAU 3306T、47:M.amorphae ACCC 19665T聚成群VIII;29.SCAU593在16SrDNA-RFLP中屬于 PhenonII，但在主成分分析中則與 28.SCAU592聚成群III。

圖5 藥用黃芪供試菌株16S rDNA系統發育樹狀圖Fig.5 Phylogenetic tree constructed by 16S rDNA sequences of tested strains

2.3 藥用黃芪根瘤菌16S rDNA序列測定和系統發育分析

根據BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA分析結果，選取20個代表菌株測定16S rDNA序列(北京華大基因科技股份有限公司)，構建了供試菌株的16S rDNA系統發育樹狀圖(圖5)。結果表明，20個代表菌株在系統發育樹狀圖中分成2個大遺傳群:SCAU516、SCAU517、SCAU519、SCAU594、SCAU595、SCAU597、SCAU470、SCAU471 與 Rhizobium 聚群，其中，來自同一宿主的根瘤菌聚成一個小群。

其余供試菌株均聚在Rhizobium-Agrobacterium:SCAU 542、SCAU433、SCAU434、SCAU436、SCAU568形成一個獨立的分支;SCAU540、SCAU551、SCAU611、SCAU591、SCAU609、SCAU550 與 Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T形成一個小分支，表明這6個菌株與Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T的親緣關系很近;而SCAU596形成一個獨立的分支。

2.4 藥用黃芪根瘤菌抗逆性分析

對35個菌株分別進行耐鹽性、初始pH生長范圍及生長溫度的測定。結果表明:27/35的菌株既能在4℃又能在45℃的恒溫條件下生長，8/35的菌株能在1037℃的恒溫條件下生長，所有菌株能在60℃(處理10 min后置28℃)條件下生長。表明供試根瘤菌對溫度的適應范圍較寬，對溫度的耐受性表現出較大的多樣性。28/35的菌株能在pH 4～10的培養基上生長，5/35的菌株能在pH 4～8的培養基上生長，而SCAU533、SCAU536僅能在pH6～8的范圍內正常生長。除12/35的菌株不能在1%NaCl的YMA培養基上生長外，多數(23/35)菌株能在2% ～8%NaCl的YMA培養基上生長，其中，SCAU542、SCAU543、SCAU544、SCAU545、SCAU546等5個菌株能在8%NaCl的培養基上生長。

3 討論

35個菌株在16S rDNA PCR-RFLP分析中除SCAU549，SCAU568，SCAU596 單獨分開外，其余菌株聚成4個遺傳群(相似系數83%);在BOXAIRPCR分析中則聚成6個遺傳群(相似系數84.6%)。很多在16S rDNA PCR-RFLP中具有相同遺傳類型的菌株也有較大差異，因此，和16SrDNA PCRRFLP結果相比較，BOXAIR-PCR指紋圖譜分析揭示的遺傳信息更為豐富［9］

采用2種方法對35株藥用黃芪根瘤菌菌株和14個參比菌株進行聚類結果較為一致，均顯示:除少數供試菌株與參比菌株聚在一起外，其它供試菌株都獨自成群，表明大多數供試菌株和參比菌株間有較大的遺傳差異，藥用黃芪根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性。是否預示著有潛在的新種，尚需進行功能基因的分析。

16S rDNA序列分析是能較精確地揭示根瘤菌的系統進化關系的一個重要手段［10］。16S rDNA序列比對結果表明，分離自10種黃芪植物根瘤的35株藥用黃芪根瘤菌分別屬于Rhizobium(20/35株)、Ochrobactrum(3/35株)、Rhizobium-Agrobacterium(12/35株)。

在系統發育樹狀圖中，供試菌株 SCAU 542、SCAU433、SCAU434、SCAU436、SCAU568 聚在 Rhizobium-Agrobacterium: 而 SCAU540、 SCAU551、SCAU611、SCAU591、SCAU609、SCAU550 與 Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T形成一個小分支，顯示這6個菌株與Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T的親緣關系很近。這表明根瘤菌屬與土壤桿菌屬在種的系統發育上互有交叉，這與Kwon SW等的研究結果相一致［11］。

一般認為，根瘤菌的最適生長溫度為25～30℃，只有少數苜蓿根瘤菌菌株在42.5℃下生長，極少數根瘤菌4℃條件下生長，根瘤菌在60℃條件下處理5 min即全部被殺死。

對藥用黃芪根瘤菌供試菌株生長溫度測定結果顯示，27/35的菌株既能在4℃又能在45℃的恒溫條件下生長，8/35的菌株能在10～37℃的恒溫條件下生長，所有菌株能在60℃(處理10 min后置28℃)條件下生長。表明供試根瘤菌對溫度的適應范圍較寬，對溫度的耐受性表現出較大的多樣性。

根瘤菌生長的最適pH 6～7。35個藥用黃芪根瘤菌菌株的宿主植物生長的土壤pH 4～7.07之間，均屬酸性、中性偏酸環境，所有菌株均能在pH 4或5的培養基上生長。其中，28/35的菌株能在pH 4～10的培養基上生長，5/35的菌株能在pH 4～8的培養基上生長，而SCAU533、SCAU536僅能在pH6～8的范圍內正常生長。韋革宏等［12］對18株分離自陜甘寧地區5種黃芪植物(扁莖黃芪Astragalus complanulus，直立黃芪Astragalus adsurgens，糙葉黃芪Astragalus scubuerrumus，金翼黃芪Astragalus chrysupterus，內蒙黃芪Astragalus mongulicus)根瘤菌的生理生化指標測定結果表明，全部供試菌株在pH 4～5的酸性環境中不能生長，卻在pH11的堿性環境中能生長，與其他來源的根瘤菌相比，它們具有較強的耐堿能力。表明根瘤菌適應環境的能力是宿主植物、無機環境因子對菌株長期自然選擇的結果。

影響微生物生長的脅迫因素中，鹽分被認為是最具危害性的非生物類脅迫因素之一。除少數(12/35)的菌株不能在1%NaCl的YMA培養基上生長外，多數(23/35)菌株能在2% ～8%NaCl的YMA 培養基上生長，其中，SCAU542、SCAU543、SCAU544、SCAU545、SCAU546等5個菌株能在8%NaCl的培養基上生長。

4 結論

川西高寒山區特殊的地理環境對生物進行了長期的自然選擇，使生長在該地區的藥用黃芪根瘤菌既具有豐富的遺傳多樣性，又形成了與自然環境條件相適應的耐高鹽、耐過酸過堿和耐高溫低溫的類型，因此，研究高寒地區豆科植物根瘤菌的遺傳多樣性和抗逆性，能為選育具有優良性狀的菌種提供資源。