5個野生云耳菌株生物學特性的研究

王燦琴，韋仕巖，吳圣進，陳雪鳳，藍桃菊，吳小建

(廣西農業科學院微生物研究所，廣西南寧 530007)

【研究意義】黑木耳 Auricularia auricula-judae(Bull.)Qué［1］，又名紅木耳、光木耳、云耳、木耳菇、川耳、黑菜等［2］，是我國三大食用菌栽培品種之一，其年產量僅次于平菇和香菇［3］。黑木耳是一種珍稀的食、藥兼用食用菌品種［4］，深受人們的喜愛，具有廣闊的市場前景。廣西的黑木耳因其獨特的口感及上好的品質統稱云耳，是本土唯一的名特優食用菌品種［5］，但長期以來廣西本土的云耳產品都是以野生采摘為主，野生云耳資源逐年銳減，甚至瀕臨滅絕。進行野生云耳生物學特性研究，對廣西野生云耳種質資源的有效保護和優異種質的發掘及創新利用具有重要意義。【前人研究進展】近年來，國內對野生黑木耳的研究報道以優良菌株的篩選為主。亢學平等［6］從6個野生黑木耳菌株中篩選出3個綜合性狀表現優良的菌株;呂玉珍等［7］也選育出一個優良的野生黑木耳菌株。對廣西本土野生云耳的相關研究報道比較多。黃艷芳等［8］對廣西野生黑木耳種質源進行了調查，發現廣西野生黑木耳集中發生在桂西、桂西北具有成片櫟林的地域;王燦琴等［9］從5個野生云耳菌株中篩選出2個綜合性狀表現較好的菌株;李發盛等［10－11］從野生云耳中分離馴化獲得一株性能穩定的優良菌株，并對其生物學特性進行了研究。【本研究切入點】廣西野生云耳種質資源豐富多樣，發生季節、地理位置等不同使得其品種的特性各異。目前僅有李發盛等［11］對馴化成功‘百云6號’菌株的生物學特性進行了研究報道。王燦琴等［9］雖然篩選出2個產量和品質較好的菌株，但未對其生物學特性進行研究。而廣西還有很多豐富的野生云耳種質資源尚待挖掘利用。【擬解決的關鍵問題】從廣西各地收集到一批野生云耳菌株，通過野生分離及馴化栽培，從中選出產量、品質均表現較好的5個菌株進行生物特性的研究，為其品種篩選及栽培試驗提供理論依據，同時為野生云耳種質資源創新利用奠定重要基礎。

表1 供試菌株來源及農藝性狀Table 1 Origins and economical characters of tested strains/varieties

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株來源及農藝性狀見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 碳源試驗 用馬鈴薯200 g、瓊脂20 g，硫酸鎂2 g、磷酸二氫鉀2 g，作為基礎培養基，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、淀粉各20 g，定容至1000 mL，pH自然，制成不同碳源的培養基，并倒入規格為9 cm的平皿。將各供試菌株接種于平皿后置于30℃恒溫培養箱內培養7 d，每個處理3個重復，觀察記錄各處理的菌絲生長情況。

1.2.2 氮源試驗 用馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，硫酸鎂2 g、磷酸二氫鉀2 g，作為基礎培養基，分別加入酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀各3 g，定溶至1000 mL，pH自然，制成不同氮源的培養基，并倒入規格為9 cm的平皿。將各供試菌株接種于平皿后置于30℃恒溫培養箱內培養7 d，每個處理3個重復，觀察記錄各處理的菌絲生長情況。

1.2.3 溫度試驗 將各供試菌株分別接種于平板(規格9 cm)培養基上，(培養基配方:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，硫酸鎂2 g、磷酸二氫鉀2 g，定溶1000 mL，pH自然)，接種后先置于30℃培養箱培養2 d，等菌絲萌動后分別置于15、20、25、30和35℃下培養，每個處理3個重復，培養7 d后觀測菌落日平均生長速度，并進行比較分析。

1.2.4 pH試驗 PDA培養基滅菌前，先用HCl溶液和 NaOH 溶液分別調至 pH 4、5、6、7、8、9、10 和11，并制成平板，平皿規格為9 cm。將各供試菌株分別接種于不同pH的培養基上，每個處理重復3次，接種后置于30℃的恒溫培養箱中培養7 d。觀測菌落日平均生長速度，并進行比較分析。

1.2.5 水分試驗 將雜木屑、棉籽殼和麥麩在50℃下烘8 h，自然冷卻后備用。配制6份配方為:雜木屑65%、棉籽殼20%、麥麩12%、石膏粉1%、過磷酸鈣1%、石灰1%的培養基。將培養基的含水量分別調至50%、55%、60%、65%、70%、75%，共6個處理。調節好含水量后將培養料裝入規格為:5 mm×200 mm的試管中，高壓滅菌2 h，冷卻后將各供試菌株分別接種于培養基中，每個處理3個重復。并置于30℃培養箱內培養10 d，觀察記錄各處理的菌絲日平均生長速度。

1.2.6 抗霉性試驗 將大小一致，并經純化培養過的7個供試菌株分別和青霉菌菌種一起接種在同一PDA平板培養基的兩邊，讓供試菌株和青霉菌進行對峙培養，每個處理3個重復，并置于30℃恒溫箱培養內培養7 d。觀察各菌株的抗青霉菌效果。

1.3 測定項目及方法

觀測、記錄碳、氮素營養條件下各供試菌株的菌絲生長情況，包括菌絲的日平均生長速度和菌絲的生長勢。其中菌絲日平均生長速度每隔4 d測量1次，取每次重復的平均值。菌絲生長速度(mm/d)=菌絲直線生長長度(mm)/菌絲生長天數(d);菌絲生長勢即菌絲生長強弱，用“++++”表示菌絲潔白，濃密粗壯，整齊。“+++”表示菌絲較潔白，較濃密粗壯。“++”表示菌絲稀疏、細弱。“+”菌絲極稀疏、細弱且不整齊。

溫度、水分及pH值酸堿性試驗都是按照一定的梯度條件進行，用曲線圖對菌絲的日平均生長速度進行比較分析。

1.4 統計分析

采用DPS v7.05軟件對各菌株在碳、氮源營養條件下菌絲日平均生長速度的各組數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 碳、氮素營養條件下各供試菌株菌絲生長表現

從表2可以看出，7個供試菌株在不同的碳素營養中表現各異，其中以葡萄糖作為碳源時，各菌株的菌絲長速雖然較慢，但長勢表現最好，均表現為潔白、濃密粗壯、整齊;蔗糖不適合作916和TY081的碳源，麥芽糖不適合作TY081的碳源，果糖不適合作為TY041、916和TY081的碳源;乳糖和淀粉作為碳源時，各供試菌株的菌絲生長均不理想，表現為菌絲生長速度較慢，且長勢稀疏細弱、不整齊、活力差，因此，6個碳源中，乳糖和淀粉不適宜作為云耳的碳源。

在適宜生長的4個碳素培養基中，TY071菌株的菌絲除了在麥芽糖上長速較慢，在葡萄糖、蔗糖、果糖3個碳源上的日平均生長速度都是最快，與2個對照相比存在差異極顯著水平，菌絲長勢以在葡萄上的表現最佳;其次表現較好的是TY026菌株，該菌株的菌絲除了在蔗糖上的長速比HME2對照菌株較慢以外，在另外3個碳源上的長速都比2個對照菌株快，菌絲長勢也表現良好;此外，TY081菌株在麥芽糖上不萌發。TY041菌株的菌絲在蔗糖上長速比兩個對照菌株快，但在果糖上長勢表現較差。YE1菌株的菌絲在葡萄糖上長速最慢，但在蔗糖上菌絲長速居第2位，且在4個適宜生長的碳源上菌絲長勢均表現良好。

從表3可以看出，6個氮素營養中，各供試菌株的菌絲在酵母粉、牛肉膏、蛋白胨作為氮源的培養基上生長表現良好，這3種氮源可作為云耳的氮素營養。其中以酵母粉作為氮源的表現最好，其次是蛋白胨，最后是牛肉膏;各供試菌株在硝酸銨、硝酸鉀、硫酸銨作為氮源的培養基上菌絲表現不理想，特別是菌絲長勢表現極差，因此，這3種氮源不適合作為云耳的氮素營養。

從各供試菌株在適宜生長的氮源表現來看，HME2對照品種的菌絲長速及長勢表現最佳;其次TY071、TY026和TY041等3個菌株的菌絲生長表現較好。除了TY041在蛋白胨上的表現比另一對照菌株916稍差以外，其它均優于對照菌株916;其余2個菌株在適宜的氮素培養基上長速最慢，除了YE1在牛肉膏上的長勢表現出菌絲稀疏、細弱、不整齊外，其它長勢均表現較好。

2.2 不同溫度條件對供試菌株菌絲長速的影響

從圖1可看出，各供試菌株的菌絲在15～30℃的溫度范圍內長速和溫度呈正比，溫度達30℃時各菌株菌絲長速最快。溫度達35℃時，除TY081菌株菌絲不能萌發外，其它菌株菌絲長速開始減慢;HME2、916，2個對照菌株在15～25℃范圍內菌絲長速比較慢，但在25～30℃的溫度范圍內，其菌絲長速反超于其它菌株，由此看出2個對照菌株更耐高溫。TY026、TY071，2個菌株的菌絲在15～25℃范圍內長速快于對照菌株，25～35℃溫度范圍內被對照菌株反超，由此說明2個云耳菌株適應的溫度范圍略低于對照菌株;YE1、TY081，2個菌株在本試驗中菌絲表現慢于其它菌株，特別是TY081菌株在35℃高溫下菌絲不能萌發。

表2 不同碳源對供試菌株生長的影響Table 2 Effect of different carbon sources on mycelial growth of tested strains

表3 不同氮源對供試菌株生長的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of tested strains

2.3 不同含水量對供試菌株菌絲長速的影響

從圖2 可知，TY026、YE1、HME2，3 個菌株在 70%的水份含量菌絲長速達到最高值;TY041、TY071、TY081、916，4個菌株在65%的水份含量菌絲長速達到最高值。由此可見幾個供試菌株的最適宜含水量在65%～70%。從各菌株的菌絲在不同水份含量的長速表現來看，TY041、TY071、TY026，3 個菌株和HME2對照菌株的菌絲長速基本上接近，且明顯快于916對照菌株;YE1和916對照菌株的菌絲長速基本接近，而TY081菌株則明顯慢于其它菌株。

2.4 不同酸堿性對供試菌株菌絲長速的影響

圖1 不同溫度對供試菌株菌絲長速的影響ig.1 Effect of different temperature on mycelial growth of tested strain

從圖3可以看出，各供試菌株的菌絲在pH 4～11的范圍內都可以生長。其中 TY041、TY071、TY081、916，4個菌株的菌絲在pH 8的堿性條件下長速最快;TY026、HME2、YE1，3個菌株的菌絲在pH 9的堿性條件下長速最快。因此，各供試菌株的菌絲生長最佳酸堿度范圍是pH 8～9。從各菌株的表現來看，TY071和TY026跟HME2對照菌株的長速很接近，且明顯快于916對照菌株;TY041和YE1雖然比HME2對照菌株慢，但明顯快于916對照菌株;TY081菌株是所有菌株中長得最慢的。

2.5 供試菌株抗青霉菌試驗表現

圖2 不同含水量對供試菌株菌絲長速的影響Fig.2 Effect of different moisture on mycelial growth of tested strains

圖3 不同酸堿度對供試菌株菌絲長速的影響Fig.3 Effect of different pH on mycelial growth of tested strains

圖4 供試菌株抗青霉菌試驗表現Fig.4 The antimicrobial activities of tested strains/varieties to Penicillium sp.

從圖4可以看出，TY081、TY026，2個菌株在跟青霉菌對峙生長的時候，其菌落面積最大，甚至在形成對峙線后還有部分菌絲可以蓋過青霉菌繼續生長，因此，這2個菌株的抗青霉菌能力最強;其次916、HME2、TY071 和 YE1，4 個菌株的菌落面積雖然較小，但形成對峙線后仍可以蓋過青霉菌繼續生長，因此，這4個菌株的抗青霉菌能力也較強;抗青霉菌能力最差的是TY041，在跟青霉菌對峙生長過程中，菌落面積小且不能蓋過青霉菌繼續生長。

3 討論

各供試菌株的菌絲在不同碳、氮源培養基上表現各異，在以葡萄糖作為碳源的培養基上，各供試菌株的菌絲長速雖然不是最快，但菌絲長勢表現最佳。以麥芽糖、果糖作為碳源時各菌株菌絲長速最快，但菌絲長勢表現一般;酵母粉是各供試菌株的最佳氮源，其次是蛋白胨。趙梓楠［12］和李發盛等［11］用同樣的碳、氮源分別對5個黑木耳和‘百云6號’云耳菌株的菌絲長速進行分析，結果與本研究基本一致，即5個黑木耳菌株的菌絲在葡萄糖上表現最好，‘百云6號’云耳菌株在酵母粉上生長最快。由此可知，葡萄糖和酵母粉是黑木耳和野生云耳的最佳碳、氮源;趙梓楠［12］的研究表明5個黑木耳的最佳溫度在25 ℃左右，李發盛等［11］和郭硯翠等［13］分別研究得出:‘百云6號’和黑木耳8808菌株的最適溫度為25～30℃。本研究表明各供試菌株的菌絲在25～30℃的溫度范圍內表現最佳，與這些結論基本一致;培養料含水量方面，李發盛等［11］認為‘百云6號’的最佳培養基含水量是65%，而本研究表明各供試菌株在65%～70%的含水量菌絲長速最快，原因可能為不同云耳菌株的含水量存在一定的差別，但最適合的含水量范圍基本一致;趙梓楠［12］認為5個黑木耳菌株在pH 5～9時菌絲長速變動不大，且菌絲較致密，菌落生長旺盛，郭硯翠等［13］也認為黑木耳8808菌株在pH 4～11.5時菌絲長勢基本相同，本研究結果表明各供試菌株在pH 4～11時菌絲都可以生長，以pH 8～9為最佳酸堿度范圍，說明黑木耳和云耳菌株適應的酸堿度范圍較大，在偏酸和偏堿性的條件下都可以正常生長。因為在偏堿性條件下可以抑制部分雜菌的生長，因此，在培養料的配制過程中可以適當加入一些石灰粉使培養料的pH值調至堿性，從而達到抑制雜菌生長，減少污染的目的。以上結果表明，可對這5個野生云耳菌株開展進一步的栽培試驗，以便對各菌株的出菇產量、外觀品質、成份含量等性狀進行評價及挖掘，以篩選出適合廣西栽培的高產優質的本土云耳栽培品種。而TY081和TY026菌株可以作為抗霉性強的育種材料進行研究利用。

4 結論

通過對5個野生云耳菌株和廣西主栽的2個黑木耳品種的生物學特性進行比較，結果表明野生云耳菌株除了適應的溫度略低于對照菌株外，其它生物學特性和對照菌株無明顯差別，均可作為廣西高產優質的本土云耳栽培品種的篩選材料。