氟樂靈對萱草多倍體的誘導

李永平，李 麗，梁 崢，賈民隆，曹冬梅

（山西省農業科學院園藝研究所，山西太原030031）

多倍體育種是培育植物新品種的一個重要途徑[1-6]。多倍體植物一般具有營養器官的巨大性[7]、植株抗性強、生長率高的優點，而這些特點恰好都符合人們對觀賞植物的育種方向，因而多倍體育種在觀賞植物育種領域很受歡迎。

秋水仙素是一種常規的、應用廣泛的多倍體育種誘變劑[8-10]，它對染色體結構以及變異的影響很小[9]，同時能夠在細胞分裂中期阻礙紡錘絲形成，進而中斷有絲分裂的過程[4]。然而，秋水仙素對植物材料和試驗者的毒害作用是不容忽視的，尋找新型、廉價、低毒的的化學試劑或其他誘導方法替代秋水仙素是目前急需解決的問題。

大花萱草屬百合科萱草屬多年生宿根花卉，具有適應性強、花大艷麗等優點，具有很高的觀賞價值。目前，萱草育種以雜交手段為主，受季節限制一年只能進行一次，雜交后代的繁殖量也很難迅速提升。山西省農科院園藝研究所觀賞植物課題組曾采用秋水仙素作為誘導劑，成功地獲得了四倍體萱草[11]。

本試驗在先前試驗的基礎上，以萱草愈傷組織和不定芽為試材，氟樂靈為誘變劑，通過浸泡法和混培法探索萱草多倍體的誘導條件，旨在為萱草多倍體育種提供更多的可能性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為山西省農業科學院園藝研究所觀賞植物研究室培育的萱草雜交品種10-154（Hemerocallis fulva 10-154）組培苗。該品種為二倍體（2X＝22）。

1.2 試驗方法

選擇生長健壯、帶有綠色芽點、組織緊密的愈傷組織，切取邊長0.5 cm左右的立方體小塊供試；選擇和分離生長健壯、長勢一致的不定芽供試。將2種材料分別用氟樂靈溶液處理，誘導方法包括浸泡和混培2種。

1.2.1 浸泡法 無菌條件下，將愈傷塊或不定芽浸入不同濃度（0，0.002%，0.006%，0.01%，0.03%）的氟樂靈溶液中，置于搖床上振蕩培養，轉速為80～100 r/min，分別于6，12，24 h時取出材料置于無菌操作臺上，用無菌蒸餾水沖洗4次，每次清洗5 min，待吸水紙吸干材料表面水分后置于分化培養基上繼續培養（分化培養基為MS＋6-BA0.1 mg/L＋KT 0.1mg/L＋NAA0.05mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂5.3g/L，培養溫度為（25±2）℃，光照為5 000 lx，光照時間為 16 h/d）。

每組處理包括愈傷組織30塊，不定芽40個，重復3次。25 d后分別統計愈傷組織存活率及其上芽的生長系數、不定芽的存活率和增殖系數。將成活植株轉入生根培養基（1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中，20 d后統計誘變率。

1.2.2 混培法 將愈傷塊或不定芽材料分別接種至添加了不同濃度（0，0.001%，0.004%，0.007%，0.01%）氟樂靈的培養基上，3，5，7d后轉入不添加氟樂靈的正常分化培養基（MS＋6-BA0.1mg/L＋KT0.1mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中繼續培養（培養溫度（25±2）℃，光照 5 000 lx，光照時間16 h/d）。

每組處理包括愈傷組織30塊，不定芽40個，重復3次。25 d后分別統計愈傷組織的存活率及其上芽的生長系數、不定芽的存活率和增殖系數。將成活植株轉入生根培養基（1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中，20 d后統計誘變率。

1.3 測定項目及方法

誘導所得材料的倍性鑒定采用染色體制片法[12]。切取再生植株的幼嫩根尖，放入對二氯苯飽和溶液中預處理5 h，蒸餾水清洗后在4℃的新鮮卡諾固定液處理22 h，然后進行水洗，并轉入70%乙醇中備用。壓片前取出備用根尖，于60℃，1 mol/L鹽酸中解離8 min，卡寶品紅染色15 min，常規壓片，Nikon顯微鏡觀察、計數并照相。每處理統計15個細胞，以具有一致的染色體數作為該植株的染色體數目。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0進行數據統計分析，所有數據均經鄧肯式新復極差測驗。

2 結果與分析

2.1 浸泡法處理對愈傷組織誘導的影響

浸泡法處理對愈傷組織誘導的影響結果表明（表1），不同濃度的氟樂靈浸泡處理后，愈傷組織隨氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長，存活率逐漸降低；不定芽增殖系數也隨氟樂靈濃度增大和處理時間的延長而呈降低的趨勢。當氟樂錄濃度為0.002%時，愈傷組織的存活率在50.00%～94.44%，愈傷塊上不定芽的增殖系數受處理時間的影響不明顯，在1.86～2.10；當氟樂靈濃度為0.006%時，愈傷組織的存活率明顯降低至25.00%～66.67%，其上不定芽的增殖系數與0.002%處理組差異不大；當氟樂靈溶液濃度增大至0.01%～0.03%時，愈傷組織的存活率明顯下降，0.03%濃度處理24 h時，氟樂靈的毒害作用使存活率降至最低點（2.78%），同時愈傷組織分化不定芽的數量迅速減少，6 h時芽增殖系數僅為0.39，隨著時間的延長，出芽數量降至0。低濃度氟樂靈溶液的處理組合誘變率很低，0.002%濃度處理組誘導率均低于10%，隨著濃度的升高和處理時間的延長，誘變率逐漸提高，0.01%處理12 h的誘導率升至22.22%；但高濃度、長時間的處理組合又使愈傷組織的不定芽分化數減少，繼而導致誘變率處于低水平。最優組合需要在獲得較高誘導率的同時保持較高的成活率，因此綜合考慮，浸泡法誘導愈傷組織染色體加倍試驗的最佳處理組合為：0.01%氟樂靈處理12 h，此時成活率為41.67%，誘變率為22.22%。

表1 氟樂靈浸泡處理對萱草愈傷組織誘導多倍體的影響

2.2 浸泡法處理對不定芽誘導的影響

用不同濃度氟樂靈溶液浸泡處理萱草不定芽的試驗結果表明（表2），不定芽存活率隨著氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長逐漸降低。當氟樂靈的濃度為0.002%時，存活率為40.00%～66.67%，不定芽增殖系數為1.65～2.13；當氟樂靈濃度上升到0.006%時，不定芽的增殖系數為1.25～1.73，當處理時間為24 h時，存活率僅為20%；當氟樂靈濃度增至0.01%～0.03%時，氟樂靈的毒害作用顯著抑制不定芽的存活率，此時存活率降至0～33.33%。低濃度氟樂靈溶液的處理組合的誘導率很低，0.002%濃度時誘導率為1.11%～8.47%，隨著濃度的升高和處理時間的延長，多倍體誘導率明顯提高，在0.01%的濃度處理6 h后，誘導率達到21.75%；但高濃度、時間長的處理容易降低誘導率，當氟樂靈濃度0.03%處理24 h時，其誘導率為0。綜合考慮，氟樂靈浸泡誘導不定芽染色體加倍試驗以0.01%處理6 h組合效果較好，此時誘導率最高，為21.75%，成活率為26.67%。

表2 氟樂靈浸泡處理對萱草不定芽增殖的影響

2.3 混培法處理對愈傷組織誘導的影響

混培法處理對萱草愈傷組織的誘導結果表明（表3），隨著氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長，萱草愈傷組織的存活率逐漸降低。當氟樂靈的濃度為0.001%時，愈傷組織的存活率在60%～80%，其上不定芽的增殖系數為1.12～1.79。此時的存活率波動幅度及其上不定芽的增殖系數波動都不大，說明較低濃度的氟樂靈對萱草愈傷組織生長狀態的影響較??；當氟樂靈濃度為0.004%時，愈傷組織的存活率在50.00%～58.33%，其上不定芽的增殖系數在0.86～1.21；當氟樂靈濃度繼續上升到0.007%時，混培處理7 d的存活率迅速下降到30%，其上不定芽增殖系數也迅速減小至0.58；當氟樂靈濃度達到0.01%、混培處理7 d時，氟樂靈的毒害作用加劇，使愈傷組織的存活率降至最低26.67%，其上不定芽的增殖系數為0.60。結果顯示，低濃度氟樂靈的處理組合對萱草愈傷組織的誘變作用很小，0.001%濃度處理組的誘導率僅為0～7.65%；隨著濃度的升高和處理時間的延長，誘導率明顯提高，0.007%濃度處理5 d的誘導率可達35.74%，同時高濃度、長時間的氟樂靈處理會導致誘導率的降低，這可能是由愈傷組織存活率低、產生不定芽的數量少導致的。綜上所述，氟樂靈混培法誘導愈傷組織染色體加倍試驗的最優組合為：0.007%處理5 d，此時愈傷組織成活率為50%，誘導率為35.74%。

表3 氟樂靈混培處理對萱草愈傷組織誘導的影響

2.4 混培法處理對不定芽誘導的影響

試驗結果表明（表4），隨著氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長，萱草的不定芽存活率逐漸降低。當氟樂靈濃度為0.001%時，存活率從3 d的87.5%下降到7 d的65.0%，不定芽的增殖系數從2.10下降到0.95；當氟樂靈濃度在0.004%時，不定芽的存活率在60.0%～72.5%，其增殖系數也呈現大幅下降的趨勢；當氟樂靈濃度增大至0.007%時，不定芽的存活率為35.0%～67.5%；當氟樂靈濃度為0.01%時，不定芽存活率為35.8%～50.0%，不定芽的增殖系數為0.41～0.61。低濃度氟樂靈的誘導率很低，本試驗氟樂靈濃度為0.001%～0.004%的處理組合誘導率均低于10%；隨著濃度的升高和處理時間的延長，誘導率明顯提高，至氟樂靈濃度0.007%、處理時間7 d時，誘導率升高至13%。較高濃度較長時間的處理組合，存活率和誘導率均處于比較低的水平，氟樂靈濃度為0.01%時，不定芽誘導率為3.04%～5.31%。綜上所述，氟樂靈混培誘導愈傷組織染色體加倍的最佳處理濃度為0.007%，最佳處理時間為7 d，此條件下，不定芽成活率為35%，誘導率為13%。

表4 氟樂靈混培處理對萱草不定芽增殖的影響

3 結論與討論

氟樂靈作為一種多倍體誘變劑，由于其毒性弱、價格低廉、誘導效果好，已在多種園藝植物上得到廣泛應用。本試驗中，若以愈傷組織作為外植體，萱草多倍體的誘導以氟樂靈濃度0.007%混培處理5 d的效果最好，成活率可達50%，誘導率達到35.74%；若以不定芽作為外植體，萱草多倍體的誘導以氟樂靈濃度0.01%浸泡處理6 h的誘變率最高，可達21.75%。前人的研究表明[13]，當氟樂靈的濃度為180 μmol/L時，對南瓜幼嫩小苗的誘導率最高，完全可以代替誘導劑秋水仙素來誘導植株加倍。這與山西省農業科學院園藝研究所觀賞植物課題組前期用秋水仙素混培處理萱草愈傷組織相比較，誘導率差異不大，但存活率明顯提高，從誘導時間上來看，氟樂靈誘導多倍體所需時間明顯低于秋水仙素處理時間[11]，秋水仙素在多倍體誘導過程中易造成染色體缺失，形成嵌合體[14-15]。因此，結合誘導率與死亡率、試驗成本、對植物的傷害、周圍環境、人體健康多方面考慮，氟樂靈作為萱草多倍體誘導的有效試劑更為合適。

在本試驗中，采用浸泡法和混培法誘導萱草多倍體植株，不同的誘導方法誘導率也不同。在試驗過程中發現，采用氟樂靈作為誘導劑，選用混培法對外植體的傷害小，誘導率高，此結果與前人的研究結果略有不同[16-17]，這可能是由于材料不同、誘導部位不同，其還有待于進一步試驗驗證。