手性殺菌劑苯醚甲環唑在火龍果中的殘留消解行為研究

張利強 邢淑蓮 林麗云 林玲 楊春亮

摘要 建立了火龍果中手性苯醚甲環唑分離并測定的固相萃取一高效液相色譜法，并比較分析不同處理濃度下苯醚甲環唑對映體在火龍果中的消解動態和立體選擇性。研究表明：苯醚甲環唑4個對映體的消解動態均符合一級動力學方程，低、高濃度處理組半衰期分別為1.78～2.34d和1.70～2.72d。EF_A在2個處理下均表現為前期大于0.5且逐漸升高，后期逐漸降低至0.4左右;EF_B在低濃度處理時整個采樣時期從0.55一直降低至0.43，而高濃度處理時，則先升高至0.6后逐漸降低至0.4左右。結果證明，苯醚甲環唑2對對映體在火龍果體內降解很快，存在立體選擇性降解行為，并且處理濃度不同，選擇性降解情況也不盡一致。

關鍵詞 手性農藥;苯醚甲環唑;火龍果;農藥殘留;消解動態

中圖分類號 S667 .9 文獻標識碼 A

手性（chiral）是自然界物質的基本屬性之一。對映體之間除偏振光作用外，其他物理化學性質幾乎相同，但在與手性的生命系統作用時常表現出明顯的差異[1]。近年來，手性農藥因具有靶點明確、藥效快、殺滅率高等特點，應用越來越廣泛。研究表明，手性農藥對映體生物活性和毒性通常差別較大，且進入生態環境后，在動植物體內的降解、代謝及轉化也往往不同[2-3]。因此，開展手性農藥對映體選擇性行為研究，將為手性農藥的環境安全評價，乃至保障食品安全都具有重要研究意義。

火龍果又名紅龍果、仙蜜果、情人果等，屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）和蛇鞭柱屬（Selenicereus）植物[4]，具有很高的食療價值和經濟效益，已成為近年來各熱區農業新、特、優、高重點開發項目之一。然而由于其種植環境多為高溫高濕地區，加上種植面積逐年擴大，導致連片地塊病害發生呈加重趨勢[5]。苯醚甲環唑作為三唑類手性殺菌劑代表品種，因具有廣譜性、持藥期長、藥效高，兼具保護、治療和內吸性等優點，已成為包括火龍果在內蔬菜水果生產中使用最廣泛、用量最大的殺菌劑之一[6]。由于其分子結構中含有2個手性中心，4個對映異構體，在不同植物體內降解、代謝和轉化等環境行為較為復雜，因此在對映體水平上開展火龍果中苯醚甲環唑選擇性環境行為研究十分必要。

目前，苯醚甲環唑在蔬菜[7-10]、水果[11-17]中的殘留與降解動態研究已有大量文獻報道，然而研究對象基本仍是外消旋形式，雖然近幾年在手性對映體水平取得了不同程度的進展，但在熱帶水果選擇性環境行為研究方面尚屬空白。因此，本文以火龍果為代表，在建立的手性拆分苯醚甲環唑對映體基礎上，模擬田間噴藥實驗，研究了其在火龍果中的立體選擇性行為規律，以期為苯醚甲環唑在熱帶水果中的風險評估提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器、自動進樣器（日本島津公司）;PL-602L電子天平（美國梅特勒-托利多公司）;24N-EVAP112型氮吹儀（美國ORGANOMATION公司）;MS-3振蕩器（德國IKA公司）;立式大容量高速離心機（日本日立公司）。外消旋體苯醚甲環唑微乳劑（10%有效成分，中國農業科學院植保所廊坊中試廠）;外消旋體苯醚甲環唑標準品（純度≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）;正己烷、丙酮、乙腈、乙醇（色譜純，德國默克公司）;氯化鈉（優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司）;其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

供試對象為2012年生紅心火龍果（品種為大紅）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

供試火龍果在湛江市湖光農場試驗基地進行，生長及水肥管理均有該基地負責實施，保證供試火龍果的正常生長發育、開花結實。

試驗設置了3個處理組，空白對照組（噴水處理）、低濃度處理組（10%苯醚甲環唑微乳劑的推薦用量，150ga.i.ha-1）、高濃度處理組（10%苯醚甲環唑微乳劑推薦用量的1.5倍，225g a.i.ha-1），每個處理組設3個平行小區，每個小區火龍果不少于5株。在火龍果坐果期施藥1次，分別于施藥后2h、1d、2d、4d、6d、8d、15d、30d采集樣品，每次每個處理組隨機采樣15個（每個小區采集5個）全部樣品分別密封于對應編號塑料袋中，迅速運回實驗室后攪碎混勻，分裝后于-20℃冰箱中貯存待測。

1.2.2 項目測定

1.2.2.1 樣品前處理

將采集的火龍果樣品，帶皮切成小片，用打碎機磨成果漿。稱取試樣10.00g于50mL離心管中，加入20.0mL乙腈于上述離心管中，混勻，加入4.0g氯化鈉，渦旋1min，再高速離心5min，之后吸取上清液氮吹至約1mL。用4.0mL乙腈-甲苯（3：1，V/V）預先淋洗石墨化炭黑/氨基小柱，等到液面近干時，把提取液加入到小柱中，再向濃縮管中加入2.0mL乙腈-甲苯（3：1，V/V），渦旋后一并加入到小柱。然后用10.0mL上述混合溶劑洗脫，洗脫液氮吹干，用正己烷定容至1.0mL，過0.22μm有機濾膜后待測。

1.2.2.2 色譜條件

手性色譜柱：Chiralcel IF-3（4.6mm×250mm，3μm），填料為直鏈淀粉-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）共價鍵合3μm硅膠，購于日本大賽璐化學工業公司。流動相為正己烷-乙醇（92：8，V/V），使用前手動搖勻。流速為1.0mL/min，檢測波長為220nm，進樣量為60μL。

1.2.3 數據處理

1.2.3.1 降解動力學分析

苯醚甲環唑的對映體在火龍果中的降解曲線用指數回歸方程來擬合，相應的降解速率常數根據以下公式來計算：

C_T==C₀e^-KT

式中：G_T為時間為T時目標化合物的殘留量，單位為mg/kg;C₀為施藥后的原始沉積量，單位為mg/kg;K為消解系數;T為施藥后時間，單位為d。

其半衰期（T_1/2）計算公式如下：

T_1/2=ln2/K=0.693/K

1.2.3.2 對映體環境選擇性分析

苯醚甲環唑有兩對對映體，苯醚甲環唑A（2R，4R與2S，4S）和苯醚甲環唑B（2R，4S與2S，4R），分別采用EF_A和EF_B作為兩對對映體之間的選擇性變化指標。

（2R，4R）-苯醚甲環唑

（2R，4R）-苯醚甲環唑+（2S，4S）-苯醚甲環唑

（2R，4S）-苯醚甲環唑

（2R，4S ）-苯醚甲環唑+（2S，4R）-笨醚甲環唑

EF值一般在0～1.0，當EF=0.5時表明兩對映體之間沒有選擇性差異，當EF值偏離初始EF值越遠，表明兩對映體之間的立體選擇性降解差異越明顯。

2 結果與分析

2.1 分析方法的驗證

以峰面積（y）為縱坐標，苯醚甲環唑對映體的質量濃度（mg/L）為橫坐標建立基質匹配標準曲線，結果表明：單個對映體在0.10～40mg/L范圍內呈良好的線性關系。4個對映體回歸方程分別為：（2R，4R）-苯醚甲環唑y₁=1707.4x1+246.8，r₁=0.9995;（2S，4S）-苯醚甲環y₂=1592.2x₂+227.0，r₂=0.9996;（2R，4S）-苯醚甲環y₃=2329.5x₃+565.7，r₃=0.9988;（2S，4R）-苯醚甲環唑y₄=1893.7x₄+384.8，r₄=0.9994。按3倍于噪音信號推算得到單個對映體的檢出限為0.02mg/L。

當外消旋苯醚甲環唑加標水平為0.4和4.0mg/kg時，苯醚甲環唑4個對映體的平均回收率為87.4%～93.0%，RSD為2.9%～4.6%（表1），滿足農藥殘留分析試驗的要求。

2.2 苯醚甲環唑對映體在火龍果中的消解動態

消解動態試驗結果（圖2）表明：施藥后當天（2h），低、高濃度兩處理組火龍果果實中苯醚甲環唑對映體原始沉積量分別為5.78、5.81、6.48、6.57mg/kg與9.54、9.50、10.34、10.49mg/kg，高濃度處理組顯著高于低濃度處理組。兩處理組樣品均在噴藥后迅速降解，到8d時苯醚甲環唑4個對映體降解率就超過95%，到15d時降解率均超過98%，到第30天時均無苯醚甲環唑檢出。

兩處理組苯醚甲環唑對映體殘留量變化趨勢均符合一級動力學方程（表2），其中低濃度處理組半衰期為1.78～2.34d，高濃度處理組半衰期為1.70～2.72d，表明苯醚甲環唑在火龍果中屬于易降解農藥，半衰期受噴施濃度影響不大。

2.3 手性苯醚甲環唑在火龍果中的立體選擇性

從EF值變化趨勢（圖3）得出，EF_A與EF_B在2h到15d時間內均處于0.4～0.6，表明苯醚甲環唑在火龍果內存在一定程度的立體選擇性降解行為，并且隨著施藥時間延長而發生變化。其中EF_A在2個處理下均表現為前期大于0.5且逐漸升高，后期逐漸降低至0.4左右;EF，在低濃度處理時整個采樣時期90.55一直降低至0.43，而高濃度處理時則先升高至0.6之后逐漸降低至0.4左右。

結合4個對映體半衰期分析，（2S，4S）-苯醚甲環唑>（2R，4R）-苯醚甲環唑，（2S，4R）-苯醚甲環唑>（2R，4S）-苯醚甲環唑，說明在2個濃度處理下苯醚甲環唑A兩個對映體在施藥后前期存在不明顯的選擇性降解，但隨著施藥時間延長，選擇性降解趨勢發生改變并且逐漸顯現，（2R，4R）-苯醚甲環唑降解速度相對變快，導致（2S，4S）-苯醚甲環唑在后期果實內逐漸積累;而苯醚甲環唑B在低濃度處理時（2R，4S）-苯醚甲環唑優先被降解，在高濃度處理前期（2S，4R）-苯醚甲環唑優先被降解，之后選擇性降解趨勢發生改變，到后期時（2R，4S）-苯醚甲環唑則降解速度相對變快，導致（2S，4R）-苯醚甲環唑在后期果實內逐漸積累。

3 討論與結論

本研究結果顯示，苯醚甲環唑4個對映體在火龍果中降解均較快，半衰期很短（<3.0d），到第8天時，苯醚甲環唑4個對映體降解率就超過95%，這與陳樹兵等[9]在小松菜、王紹敏等[10]在黃瓜、王素琴等[14]在石榴、周松等[16]在草莓中的研究結果基本一致（<4.0d），說明苯醚甲環唑在田間使用中屬于易降解農藥。但半衰期要短于劉艷萍等[17]在香蕉中（7.9～12.9d）、高川等[12]在葡萄中（5.6～16.4d）的研究結果。原因可能是每種植物體內的環境或者代謝酶活性不同，而且已有研究表明溫度、光照強度、降雨量等氣候條件對苯醚甲環唑降解也會產生影響。就本研究對象火龍果而言，具體原因還需要深入研究驗證。

本研究實驗還證明，在火龍果體內苯醚甲環唑存在一定程度的立體選擇性降解行為，并且處理濃度不同選擇性降解情況也不盡一致，但隨著施藥時間延長苯醚甲環唑A和苯醚甲環唑B降解趨勢逐漸歸于一致，導致（2S，4S）-苯醚甲環唑海（2S，4R）-苯醚甲環唑在后期果實內逐漸積累，這與賀敏[18]在水稻植株內的研究結果EF_A和EF_B均小于0.5，李晶[19]在番茄中的研究結果（2S，4S）-苯醚甲環唑和（2S，4R）-苯醚甲環唑最終在番茄果實富集均一致。然而，本研究發現的不同濃度處理時選擇性降解趨勢發生改變的原因還需進一步研究。

本研究建立了對火龍果中手性苯醚甲環唑分離并測定的固相萃取一高效液相色譜法，并比較分析不同處理濃度下苯醚甲環唑對映體在火龍果中的消解動態和立體選擇性，發現苯醚甲環唑4個對映體在火龍果中降解符合一級動力學，并存在一定程度的立體選擇性降解行為。

參考文獻

[1]唐夢齡，王丹，傅柳松，等.手性農藥毒性機制的對映體選擇性[J].農藥學學報，2011，13（4）：35-340.

[2]Garrison A W.Probing the enantioselectivity of chiralpesticides[J].Environmental Science andTechnology，2006，40（1）：16-23.

[3]李朝陽，張智超，張玲，等.擬除蟲菊酯農藥和氰戊菊酸手性分離的研究[J].分析試驗室，2006（11）：11-14

[4]鄧仁菊，范建新，蔡永強.國內外火龍果研究進展及產業發展現狀[J].貴州農業科學，2011，39（6）：188-192.

[5]王會會，符碧海，戴俊，等.火龍果潰瘍病菌的鑒定及室內藥劑篩選[J].中國南方果樹，2016，45（1）：8-12，17.

[6]董兆克，吳學宏，耿麗華，等.北京市西瓜甜瓜病蟲害化學防治現狀及展望[J].中國瓜菜，2014，27（5）：71-75.

[7]Wang Z H，Yang T，Qin D M，et al.Determination anddynamics of difenoconazole residues in Chinese cabbage andsoil[J].Chinese Chemical Letters，2008，19（8）：969-972.

[8]Dong F S，Li J，Chankvetadze B，et al.Chiral TriazoleFungicide Difenoconazole：Absolute Stereo chemistry，Stereoselective Bioactivity，Aquatic Toxicity，andEnvironmental Behavior in Vegetables and Soil[J].Environmental Science&Technology;，2013，47（7）：3386-3394.

[9]陳樹兵，湛江華，徐銀君，等.苯醚甲環唑、氟蟲脈在小松菜中的消解動態[J].浙江農業科學，2012（4）：548-550.

[10]王紹敏，宋國春，李喆，等.苯醚甲環唑在黃瓜和土壤中的殘留及安全性評價[J].北方園藝，2012（22）：127-130.

[11]Mohapatra S.Dynamics of difenoconazole and propiconazoleresidues on pomegranate over 2 years under fieldconditions[J].Environmental Science and Pollution Research，2016，23（6）：5795-5806.

[12]高川，張肖肖，覃慧麗，等.苯醚甲環唑在葡萄中的殘留分析及消解動態[J].農藥，2013，52（3）：202-203，206.

[13]Banerjee K，Oulkar D P，Patil S H，et al. Degradation kineticsand safety evaluation of tetraconazole and difenoconazoleresidues in grape[J]. Pest Management Science，2008，64（3）：283-289.

[14]王素琴，沈瑩華，于福利.苯醚甲環唑和嘧菌酯在石榴中的殘留行為與合理使用評價[J].現代農藥，2017，16（6）：41-44，51.

[15]Huan Z B，Xu Z，Lv D Z，et al. Dissipation and Residues ofDifenoconazole and Azoxystrobin in Bananas and Soil in TwoAgro-Climatic Zones of China[J]. Bulletin of EnvironmentalContamination and Toxicology，2013，91（6）：734-738.

[16]周松，張玉濤，張秋云，等.三唑酮和苯醚甲環唑在草莓及土壤中殘留消解動態（英文[J]. AgriculturalScience&Technology;，2017，18（10）：1873-1877.

[17]劉艷萍，王思威，劉豐茂，等.四種常用三唑類殺菌劑在香蕉上殘留行為及使用評價研究[J].植物保護，2014，40（5）：100-105.

[18]賀敏.苯醚甲環唑手性異構體活性差異及其在稻田的立體環境行為[D].北京：中國農業科院，2016.

[19]李晶.三唑類手性殺菌劑苯醚甲環唑的立體選擇性生物活性與環境行為研究[D].北京：中國農業科學院，2012.