化痰通絡湯預先灌胃的合并高脂血癥腦缺血大鼠神經系統功能、腦組織病理變化觀察

張振強 ，賈亞泉，王自闖，郭藝青，張金燕，李芹，宋軍營

(1河南中醫藥大學科研實驗中心，鄭州450046；2 河南中醫藥大學第二臨床醫學院)

高脂血癥是一種全身性脂代謝紊亂性疾病，也是缺血性腦血管病的主要危險因素。高血脂引起內皮細胞損傷和血管舒張功能障礙，血管內皮功能障礙能夠引起一氧化氮(NO)、血管內皮素-1(ET-1)、前列環素(PGI2)、血漿血栓素(TXB2 )等血管調節因子的變化，進而引起動脈粥硬化和缺血性腦損傷[1，2]。缺血性腦損傷后血管新生主要是血管內皮細胞的增殖、遷移、分化、細胞外基質降解、管腔形成和毛細血管生成等[1]。NO、ET-1可共同維持血管張力，反映血管內皮功能。血管內皮生長因子(VEGF)是一種具有神經營養和神經保護作用的血管生成蛋白，CD34 是最敏感的新生血管內皮標記物[3，4]。有研究[3]表明，在高脂血癥狀態下血管內皮功能受損時血液VEGF 水平下降，且對缺血后腦組織仍有毒性作用。VEGF能夠通過刺激NO的作用顯著地增強血管的舒張，促進受損內皮功能的修復[4]。我們前期實驗研究發現高脂血癥合并腦缺血患者血漿中vWFET-1、NO的表達水平低于單純腦缺血、高血脂患者。化痰通絡湯由法半夏、橘紅、枳實、黃芪、丹參、山楂、川芎、雞血藤等中藥材配制而成，具有益氣活血，化瘀通絡之功效，對腦血管疾病具有一定的保護作用。目前關于化痰通絡湯對高脂血癥合并腦缺血動物模型中的治療作用相關報道罕見。2016年12月～2017年2月，我們觀察了化痰通絡湯預處理對高脂血癥合并腦缺血模型大鼠的治療作用，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器 SPF級SD大鼠70只，雄性，體質量(220±10)g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，質量合格證號：37009200004690。化痰通絡湯加減[5](組成：法半夏12 g、橘紅10 g、枳實10 g、黃芪30 g、丹參25 g、山楂20 g、川芎12 g、雞血藤 18 g，以上八味水煎后，濃縮至相當于原生藥材1.33 g /mL，備用)；檸檬酸(批號：20090306)和檸檬酸鈉(批號：20070403)均購自北京化學試劑公司。兔抗鼠VEGF和CD34單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。試劑盒NO、ET-1和VWF試劑盒購于南京建成生物工程有限公司。酶標儀(Thermo，型號1510)；洗板機(Thermo，型號：888)；顯微鏡(OLYMPUS，BX61)；切片機(LEICA，2245)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司，型號FA/JA-B)；動物血尿生化分析系統(IDEXX，Procyte DX)。

1.2 高脂血癥合并腦缺血模型制備與化痰通絡湯給予方法 大鼠適應性飼養3天后，斷尾取血檢測血脂四項值，每天給予高脂飼料(組成：3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎飼料)喂養，共喂養6周。分別于高脂飼養前、飼養6周時斷尾取血，檢測大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白降低(P均<0.05)，則說明高脂血癥模型制備成功。將高脂血癥模型大鼠隨機分為高脂血癥對照組(正常組)15只、高脂血癥假手術組(假手術組)15只、高脂血癥合并腦缺血組模型組(模型組)20只、治療組20只，按預實驗死亡率25% 計，保證造模成功后取材的動物數共70只。飼養第7周開始，治療組予化痰通絡方1.330 g/(kg·d)灌胃處理，正常組、假手術組和模型組予等體積生理鹽水，連續4周，每天1次。飼養第9周時，模型組和治療組根據Longa[6]報道的線栓法建制備腦缺血模型： 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中切口鈍性分離皮下組織，暴露暴露左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)。結扎ECA、CCA，并穿線于ICA，用中號動脈夾夾閉ICA。用眼科剪將CCA剪一小切口，由此迅速插入線栓，輕推線栓使之由頸總動脈通過分叉部進入頸內動脈，至大腦中動脈的起點，插入深度約18～22 mm，使其阻斷大腦中動脈的血液供應。手術過程中用白熾燈加熱維持動物體溫。假手術組手術過程與模型組相同，分離出左側的CCA、ECA、ICA，不結扎血管，不插入線栓。正常組大鼠不做任何處理。

1.3 各組大鼠 神經系統功能及腦梗死體積測算 飼養11周時，5分制評分方法[6]評定模型組、治療組大鼠神經系統功能。0分：無體征；1分：動物右側下肢不能完全伸展；2分：右下肢癱瘓，出現追尾現象；3分：肢體癱瘓，不能站立；4分：動物昏迷，無自主性活動。評級越高，大鼠的行為障礙越嚴重。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦組織，去掉小腦，-20 ℃冰箱冷凍20 min。取出腦組織第一刀切在腦前極與視交叉連線中點處，第二刀切在壞死區呈白色，未壞死區顏色呈淡紅色視交叉部位，第三刀切在漏斗柄部位，第四刀切在漏斗柄與后葉尾極之間，將腦組織切成5～6片，將切片置于1%四氮唑紅中，錫箔紙蓋住37 ℃避光染色10～30 min，4%多聚甲醛中固定，拍照觀察并測算腦組織壞死區面積，計算腦梗死體積比。腦梗死體積比=梗死體積/全腦體積×100%。

1.4 各組腦組織NO、ET-1和vWF檢測 采用ELISA法。飼養11周時，取各組大鼠，腹腔注射麻醉，斷頭取腦，去除嗅腦、腦干、小腦，用預冷的生理鹽水洗去表面殘血，用濾紙吸干表面殘液，稱重，用事先預冷的生理鹽水按質量與體積比為1∶9的比例，冰浴下制備成10%的腦組織勻漿液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存，依照試劑盒說明書步驟，ELISA法檢測腦組織中NO、ET-1和vWF的含量。重復3次，取平均值。

1.5 各組大鼠腦組織VEGF、CD34檢測 采用免疫組化法。飼養11周時，取各組大鼠，麻醉后剪開胸腔，充分暴露心臟。首先在右心耳剪一小口，從左心室先灌注生理鹽水，待大鼠前肢和兩肺變白，流出液澄清無血色，改用4%的多聚甲醛灌注固定。斷頭取出全腦，除去小腦，4% 的多聚甲醛固定保存，石蠟包埋切片。常規脫蠟脫水；用3 % H2O2室溫下7 min滅活內源性酶，蒸餾水洗3次；熱修復抗原，PBS洗2次；滴加5% BSA封閉液，室溫20 min；分別滴加相應稀釋的一抗(VEGF和CD34均為1∶400)，4 ℃過夜，PBS洗3次；滴加二抗37 ℃孵育20 min，PBS洗3次；滴加SABC，37 ℃孵育20 min，PBS洗4次；DAB顯色，反應7 min左右，蒸餾水清洗；蘇木素復染，1 %的鹽酸酒精分化1 s，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro-Plus 7.0圖像分析系統測其平均光密度值。以平均光密度值代表VEGF、CD34的陽性表達量。重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 治療組、模型組大鼠神經功能評分及腦梗死體積比比較 治療組與模型組大鼠神經功能評分分別為(1.63±0.20)、(3.11±0.22)分，二者比較，P<0.05。治療組與模型組大鼠腦梗死體積比分別為16.82%±7.18%、32.97%±9.86%，二者比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較見表1。

表1 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較

注：與正常組、假手術組比較，aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽性表達量比較 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽性表達量比較見表2。

表2 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽性表達量比較

注：與正常組、假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

中醫認為，高脂血癥合并腦缺血的核心病機為痰瘀阻絡，痰濁和瘀血同時又是臟腑功能失調、氣血津液代謝失常的病理產物，治以化痰祛瘀通絡，即“痰化癖去，腦絡暢達，氣血流通，疾病方能向愈”。化痰通絡方藥由法半夏、橘紅、枳實、黃芪、丹參、山楂、川芎、雞血藤八味藥組成。半夏化痰，雞血藤活血通絡；川芎血中氣藥，丹參味涼血活血，二藥合用具有行氣活血祛瘀之作用；橘紅理氣化痰，枳殼行氣解郁，黃芪健脾益氣，山楂活血消食，食積亦為痰瘀之源，諸藥合用可謂標本同治。

近年來，中藥治療對腦缺血后的血管新生影響的研究也漸成為研究熱點。缺血區微血管的新生對于腦卒中的治療和神經功能恢復至關重要，腦缺血后血管新生機制復雜，由多種促血管生長因子參與。VEGF是主要的調控因子，能夠作用于血管內皮細胞的特異性多功能因子，誘導內皮細胞增殖以及毛細血管瓣的生成，從而促進新生血管的生成，VEGF還通過誘導內皮細胞內的抗凋亡蛋白表達維持新生血管中內皮細胞的生存[7～10]。CD34是血管內皮細胞標志物，可作為檢測微血管密度的首選標志物[11，12]。新形成的側枝血管可改善缺血區周圍的組織灌流及腦缺血后的神經功能恢復[13]。本研究結果顯示，模型組腦組織VEGF、CD34表達增加，化痰通絡方藥作用后VEGF和CD34的表達增加更顯著，而且神經功能評分降低，缺血面積減少。這表明化痰通絡方藥能夠預防性治療高脂血癥合并腦缺血引起的大鼠腦組織損傷，并通過對血管調節因子VEGF和CD34表達的上調發揮作用，修復高脂血癥條件下的缺血組織邊緣區血管內皮功能。也有研究[14～16]表明，VEGF表達的增加能夠VEGF減少腦梗死面積、減輕腦水腫、促進受損內皮功能的修復的作用，說明血管調節因子在高脂血癥條件下的缺血不同時期既有累積現象又有特異性的表達，可能有助于腦缺血恢復期損傷的修復[1]。

本研究結果還顯示，治療組腦組織NO含量顯著增加，ET-1和vWF含量顯著降低，提示化痰通絡方藥在修復高脂血癥條件下的缺血腦組織的血管內皮功能障礙方面具有重要作用。vWF是關鍵的參與缺血性腦中風的因素，當腦組織發生缺血時，vWF表達明顯增加。也有研究[1]發現，ET-1/ NO表達量下降，可能有利于腦缺血損傷的恢復。NO 是許多血管生長因子的下游介質，所以能夠與VEGF相互協調共同作用促進血管新生[17]，但這個機制還需要進一步的研究證實。

綜上所述，化痰通絡湯預先灌胃的合并高脂血癥腦缺血大鼠的神經系統功能、腦梗死體積均減少，其機制可能為促進腦組織NO、VEGF、CD34表達，降低ET-1和vWF含量。