基于多維蛋白質組學的孤兒受體NR2F2功能研究

丁 銘 秦兆宇 丁 琛,3 賀福初,2,4

(1復旦大學生物醫學研究院 上海 200032; 2國家蛋白質科學中心 北京 102206; 3復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室 上海 200438;4蛋白質組學國家重點實驗室-北京放射醫學研究所 北京 102206)

核受體是一類在生物體內廣泛分布的、配體依賴的轉錄因子超家族,成員眾多,可分為3類:類固醇激素受體、非類固醇激素受體和孤兒受體。核受體與相應的配體及其輔調節因子相互作用,調控基因的協調表達,從而涉及到如控制胚胎發育、細胞生命活動和穩態等重要的生理功能。除了正常的生理功能外,核受體家族成員還參與眾多疾病,如癌癥、糖尿病、類風濕關節炎、哮喘及激素抵抗綜合征等。目前已知的人體核受體共有48個,其中25個為孤兒受體[1],其內源性配體及功能尚不明確。

我們在前期工作中篩選出多個孤兒受體與肺癌發生相關,其中包括NR2F2 (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factorⅡ)。NR2F2在生命體內多個組織器官中廣泛存在,在胃、小腸、結腸中有較高的表達[2],在乳腺癌、前列腺癌、結腸癌以及肺癌等多種腫瘤組織中也廣泛存在[3]。NR2F2參與神經細胞的發育、視覺細胞以及血球細胞的生成。NR2F2的表達與小鼠出生早期胚胎發育相關,NR2F2缺乏的幼鼠會出現神經系統發育紊亂、出生缺陷或出生致死現象;還有研究表明NR2F2對于心血管的形成及心血管相關疾病起到至關重要的作用[4]。NR2F2在多種生命活動中起重要作用,但其具體功能以及參與調控的靶基因尚不明確。

本研究利用我們前期開發的轉錄因子快速鑒定模型(catTFREontips,TOT)技術[5],首先快速鑒定出活性受NR2F2影響的下游內源性轉錄因子;然后通過RNA-seq和全蛋白質譜(protein profiling-MS)檢測,進一步發現NR2F2直接或間接調控的下游靶基因,并利用實時定量PCR (real time quantitative PCR,qPCR)和Western blot對上述基因進行驗證,以期探索NR2F2的具體功能。

材 料 和 方 法

主要試劑與材料HEK293T、A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。RPMI 1640和1X(10-040-CVR)購自美國Corning公司,Xba1快切酶(FD0685)、Nhe1快切酶(FD0973)和蛋白質預染標志物(SM0671)購自美國Fermentas公司,PrimeScript?RT試劑盒(DRR037A)和SYBR?PremixExTaqTM(DRR041A)購自日本Takara公司,TransZolUP(ET111-01)購自北京全式金生物技術有限公司,BCA蛋白質濃度測定試劑盒(P0012)和一抗稀釋液(P0023D)購自碧云天生物技術研究所。

質粒構建NR2F2質粒來自于美國貝勒醫學院,將Flag-NR2F2質粒連接到慢病毒載體pCDH-puro上,軟件設計引物序列:正義鏈,5’-TGCTCT-AGAACCACCATGGATTACAAGGAT-3’;反義鏈,5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTGAATT-GCCATATACG-3’。

過表達穩定株的構建轉染前一天準備293T細胞,轉染1 h前換為無血清的培養基6 mL,取2支離心管(1.5 mL)各加入Opti-MEM培養基600 μL,其中一支加入4 μg pCDH-Flag-NR2F2、1 μg pSD和3 μg psPAX2,另一支加入4 μg pCDH-puro、1 μg pSD和3 μg psPAX2,再加入待轉染質粒和24 μL PEI轉染試劑。混勻后靜置20 min,滴加到培養皿中,4～6 h后換為正常培養基,48 h后取病毒上清,感染A549細胞。

Westernblot待細胞長到90%的匯合度時,用SDS裂解液提取全蛋白質,用BCA法測蛋白質濃度,配置10%的SDS-PAGE凝膠,電泳后進行轉膜,一抗稀釋液稀釋,4 ℃孵育過夜,二抗(2%奶粉溶液稀釋)室溫孵育1 h,用ECL發光試劑孵育,Las4000儀器掃膜獲取蛋白條帶。

catTFREontip收集細胞與提取核蛋白:pCDH-NR2F2過表達組與pCDH對照組各準備兩皿細胞,胰酶消化收集,細胞沉淀用低滲溶液重懸,冰置30 min,液氮速凍,-80 ℃冷凍。制備TFRE-easy Tip:分別向T400槍頭中加入乙腈100 μL,靜置1 min,200×g離心1 min。分別向T400槍頭中加入BC200溶液100 μL,200×g離心2 min。DNA和M280磁珠結合:每個樣品取20 μL M280磁珠,分別加入0.5 pmol/L (1 μg) TFREDNA,置于4 ℃垂直混勻30 min。加載磁珠:將磁珠用少量體積的BC200重懸并轉移至T400槍頭中,分別加入約50 μg核蛋白,并與磁珠充分混勻。冰上靜置10 min后500×g離心,每5 min將離心沉淀的核蛋白重新加入T400槍頭中,并充分混勻磁珠。在去除非特異蛋白質之后轉移磁珠到新的T400槍頭中。磁珠上酶解:加入胰酶溶液,37 ℃靜置1 h。乙腈洗脫:使用100 μL 50%乙腈(含有0.1%甲酸)洗脫,混勻后振搖5 min,300×g離心3 min,合并2次洗脫液,置于真空干燥儀抽干。將干燥后的肽段重新溶解到0.1%甲酸溶液中,溶解后樣品在QExactivePlus質譜儀(美國ThermoFisher公司)上進行分離和質譜檢測。利用MaxQuant對蛋白質進行定量,蛋白質和肽段水平錯誤發現率(false discover rate,FDR)小于0.01。

全蛋白質譜測定樣品裂解:樣品[(1～1.5)×106個細胞]中加入100 μL 8 mol/L尿素裂解液,置于冰上裂解15 min,超聲后用Bradford法定量蛋白質,取10 μg蛋白質樣品進行還原烷基化。FASP酶解:將裂解液加入超濾膜,裝入套管,600 r/min渦旋1 min;裝入套管,14 000×g離心15 min,棄廢液;分別加200μL 8 mol/L尿素裂解液,600 r/min渦旋1 min,14 000×g離心15 min,棄廢液;然后加入200 μL 50mmol/L碳酸氫銨溶液,14 000×g離心15 min,棄廢液;加入胰蛋白酶,37 ℃消化4～6 h。酶解完成后14 000×g離心10 min,收集溶液。將樣本濃縮合并至新離心管中,真空干燥。sRP:將抽干的樣品梯度洗脫到對應的1.5 mL EP管中(表1),置于真空干燥儀抽干,進行質譜鑒定。干燥后的肽段重新溶解到0.1%甲酸溶液中,溶解后樣品在QExactivePlus質譜儀上進行分離和質譜檢測。利用MaxQuant對蛋白質進行定量,蛋白質和肽段水平FDR<0.01。

表1 樣品洗脫梯度Tab 1 Gradient of sample solution

RNA-seq對照組和實驗組各一皿細胞,1×PBS清洗后分別加入1 mL Trizol試劑,轉移到1.5 mL EP管中,吹打混勻,靜置30 min,保存于-8 ℃,由華大基因公司進行RNA-seq實驗。

RT-qPCR用Trizol試劑提取總RNA,逆轉錄以后進行RT-qPCR,上、下游的引物序列見表2。

LC-MS/MS質譜待測樣品通過NanoLC-MS/MS納升液相高分辨質譜聯用系統(Easy-nLC1000液相/QExactivePlus高分辨質譜儀/Nano-flex ESI離子源,美國ThermoFisher公司)進行分離和檢測。液相自制預柱360 μm×2 cm,自制分析柱150 nm×10 cm,填料均為C18 (1.9 μm,120 A),(德國Dr.Maisch公司)。質譜上樣:10 μL上樣緩沖液(5%甲醇+0.2%甲酸)溶解待測樣品,加入上樣孔中,自動進樣。

生物信息學分析利用IBQA (intensity based absolute protein quantification)方法定量計算蛋白質豐度并進行FOT(fraction of total protein)校正(將IBAQ值轉換為占個組IBAQ總值的比例),通過計算實驗組與對照組的FOT比值(fold-change)篩選顯著性差異表達的蛋白質。對于轉錄組數據(質控FPKM>1),我們通過計算實驗組與對照組的fold-change來篩選顯著性差異表達的基因。最后通過R、DAVID6.8等軟件進行分析和繪圖。

表2 RT-qPCR引物Tab 2 RT-qPCR primer

統計學處理采用Graphpad 5.0軟件對所有數據進行統計處理,采用雙側t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

結合多維蛋白質組學對NR2F2進行功能研究通過TOT實驗對轉錄因子結合活性進行檢測,尋找NR2F2調控的轉錄因子;篩選顯著性變化的轉錄因子,通過RNA-seq和全蛋白質譜來尋找這些轉錄因子下游靶基因,以此深入闡述NR2F2具體功能(圖1A)。我們選用人非小細胞肺癌細胞系A549構建過表達穩定株,通過免疫熒光實驗驗證pCDH-Flag-NR2F2能夠在細胞核內穩定表達(圖1B)。以空質粒pCDH為陰性對照,pCDH-NR2F2為過表達穩定細胞株分別進行RT-qPCR和Western blot進行過表達效率的驗證,均證明pCDH-NR2F2組能夠顯著過表達目標基因(圖1C、1D)。

蛋白質非標定量質譜分析及數據可靠性分析以空質粒pCDH為陰性對照,過表達pCDH-NR2F2的穩定株細胞為實驗組,分別進行TOT-MS和全蛋白質譜,上述實驗均完成3次生物學重復,結果顯示相關性較高(r=0.9,圖2A)。同時對實驗組和對照組的細胞進行RNA-seq,通過計算log2(fold-change)數值展示出轉錄組與蛋白質組的分布密度(圖2B),顯示轉錄組與蛋白質組之間的差異性。在完成TOT、全蛋白質譜和RNA-seq之后,結合三維蛋白質組學的數據進行整合分析(圖2C):通過TOT數據尋找差異表達的轉錄因子;利用CELLNET網站(http://cahanlab.org/macellnet.html)從轉錄組和蛋白質組的結果中尋找上述轉錄因子對應的差異表達靶基因;通過對這些顯著差異表達的基因進行功能聚類,尋找NR2F2調控的下游靶基因及信號通路。

轉錄因子-DNA結合活性的改變及功能分析整合3次TOT實驗結果,共鑒定出2 891個蛋白質,其中519個為轉錄因子(unique peptide>1,1%FDR);篩選3次生物學重復中至少出現2次的轉錄因子,計算其iBAQ定量值并進行FOT校準,進一步篩選fold-change>1.5或<0.67的轉錄因子(表3)。上述TFs與DNA的結合活性可能受到NR2F2的調控。對這些差異性表達的轉錄因子進行GO/KEGG功能聚類分析,發現NR2F2能夠上調NF-κB信號通路和TNF信號通路等免疫調控相關的轉錄因子,同時下調細胞周期和TGF-β信號通路等相關轉錄因子(圖3A),與TGF-β相關的SMAD家族成員SMAD2/4/5的轉錄活性亦受到顯著下調。

下游靶基因功能分析利用CELLNET網站的轉錄因子-靶基因數據庫,匹配到上述顯著性變化轉錄因子(fold-change>1.5或<0.67)的靶基因,同時與RNA-seq(FPKM>1,fold-change>1.5或<0.67)和全蛋白質譜(fold-change>3或<0.33)的結果進行比較,獲得可能直接或間接受NR2F2調控的高可信度的下游轉錄因子功能聚類分析(圖3B)發現,這些靶基因多被富集到Toll-like通路、T/B cell通路等免疫信號通路(圖3C)。NF-κB家族功能性亞單位NF-κB2、RELB也都發生顯著上調。此外,細胞周期、P53信號通路和AMPK信號通路等均受到顯著下調(圖3D)。基于以上結果,能夠預測NR2F2參與免疫以及細胞周期等功能調控。

NR2F2對NF-κB以及細胞周期信號通路的調控作用過表達NR2F2之后,多種免疫信號通路相關的轉錄因子及其下游靶基因顯著上調(如NF-κB2、RELB),同時神經營養因子調控、細胞發育和腫瘤調控等多種信號通路相關的轉錄因子及其靶基因也會發生顯著上調(圖4A)。但與細胞周期信號通路相關的轉錄因子及其靶基因發生顯著下調。為了進一步驗證上述結果,我們在NR2F2穩定株中對部分靶基因的轉錄水平進行了RT-PCR檢測,結果證實NF-κB2、RELB發生顯著上調(P<0.05,圖4B)。同時發現,細胞周期相關分子CCND3(cyclinD3)、CDKN1A(P21)均發生顯著下調(P<0.05,圖4C),TP53也發生顯著下調;通過Western blot實驗證實上述轉錄因子在蛋白質水平也發生顯著變化(圖4D)。上述結果證明NR2F2可能通過上調NF-κB2、RELB參與細胞免疫,同時通過下調CCND3(cyclinD3)、CDKN1A(P21)及TP53等參與細胞周期相關的功能調控。

A:Experiment workflow (over-expression,TOT,RNA-seq and protein profiling-MS);B:Immunofluorescence showed exogenous NR2F2 can be successfully expressed in the nucleus;C and D:Over-expression effects verified by Westren blot and RT-qPCR.(1)P<0.01.

圖1結合多維蛋白質組學手段對NR2F2進行功能研究
Fig1FunctionsofNR2F2revealedbymulti-dimensionalproteomics

討 論

NR2F2在腦、神經及心臟中表達水平較高,其在神經發育、心血管發育中起重要作用。NR2F2調控多種發育相關轉錄因子,敲低NR2F2導致心臟房室隔發育不全[6];胚胎期間,NR2F2在靜脈中高表達,在早期軀干發育過程中,Notch信號通路通過調控NR2F2的表達影響靜脈分化[7];NR2F2在心臟收縮和心臟舒張的過程中也起重要作用[8];它還能參與部分缺血性損傷修復[9],與先天性心臟缺失有一定關系[4]。

研究表明NR2F2的下調還能抑制成骨細胞和脂肪細胞分化進程[10]。并且在神經干細胞分化過程中激活中樞神經相關的調控基因,在神經發育過程中,NR2F2常作為早期神經系統發育的標志物[11]。在小鼠星形膠質細胞中,NR2F2能上調或下調一些下游靶基因,如Ccl2、Lcn2、Chgb等[12]。同時NR2F2還能通過調控激素受體來調控滋養層的發育。研究表明,NR2F2能調控激素的分泌,例如敲低NR2F2導致雄性小鼠睪丸的缺失[13];NR2F2能通過調控雌激素受體的表達來調控腎素、高血壓蛋白酶原的表達[14];它還通過調控孕酮旁分泌信號通路來調控子宮基質基因的表達,在正常子宮高表達,在子宮內膜異位的患者中低表達[15]。

A:The left depicted the correlation between the 3 biological replicates in the control and over-expression groups in the TFRE experiment,the right one depicted the correlation between the three biological replicates in protein profiling experiment;B:The correlation between the quantified proteome and transcriptome changes of gene product after NR2F2 over-expression is shown as a density scatterplot.The abscissa is the quantitative value of FPKM log2 (fold-change) (OE/control) and the ordinate is the quantitative value of IBAQ log2 (fold-change) (OE/control);C:The workflow of bioinformatics analysis.

圖2 蛋白質非標定量質譜分析及數據可靠性分析Fig 2 Protein label-free quantitation mass spectrometry analysis and reliability analysis of data

(續表3)

ZNF56839.923 725 65NOC4L0.560 841 077NPAS238.737 937 32USF20.546 450 232RFXANK38.074 993 56BATF30.542 585 219ZNF69135.473 407 91TCF200.535 364 725ZNF57429.334 441 79MEF2D0.532 419 262BNC228.941 397 67SP10.528 644 935RUNX127.096 687 44ZFX0.501 259 995CEBPD23.508 901 17PRDM100.498 854 44ZNF14221.081 902 18ZNF3840.498 520 561MNX117.326 784 23RBL10.473 415 631ZNF27714.325 794 26CDC5L0.470 167 586NOC3L14.162 596 23NR0B10.446 067 353MEIS313.396 864 6SMARCC10.440 841 74ATF612.680 530 27FOXK20.438 189 23ZNF63911.024 568 52ZNF1480.431 581 19ZNF64410.955 692 41SP30.421 759 54ZNF3118.818 207 961SMARCE10.399 737 081CLOCK8.086 776 359DMAP10.382 927 449MYNN6.814 762 519NFYB0.377 947 182ZNF4626.501 869 196KLF160.376 397 137HMG20B5.725 960 508RXRA0.344 385 108MLX3.723 472 84ZNF2810.318 014 34DNAJC13.519 318 314ZNF7400.312 795 93ERF2.924 407 439AHCTF10.307 023 69MLXIP2.707 903 301C17orf490.300 712 791NFAT52.494 693 722MTA20.295 886 006STAT22.350 461 302DNAJC10.266 410 262DOT1L2.332 342 494BPTF0.266 213 378PPARG2.323 510 968CUX10.265 309 996STAT12.289 439 083EP4000.264 007 11NFKB22.171 317 223MAZ0.256 503 284HNF1A2.149 364 661ZBTB7A0.250 638 697FOXK10.239 871 816ELF10.239 815 543MTA10.200 178 305ZBTB200.189 641 983BBX0.170 861 87ZZZ30.157 122 025ZBED10.143 521 659ADNP0.117 172 001ZNF1430.108 283 398MYBL20.103 039 666ERF0.084 013 081STAT20.082 657 248RREB10.081 287 78TP530.081 176 277GATAD2B0.075 883 866SIX40.064 688 107CHD60.063 389 145ZNF2170.062 703 166TFDP20.055 106 69FOXJ30.051 144 696

(續表3)

GATAD2A0.049 993 403ZBTB400.048 236 218MTA30.045 776 393GATAD10.042 329 079ZNF240.027 838 461SMAD40.026 622 923ZNF1460.024 245 678RFX50.023 597 564NR2C10.022 142 84SMAD20.020 478 522TOX40.017 652 834TGIF10.016 159 982ZNF2070.015 770 867FOXP10.011 576 512SPIB0.008 762 001MNT0.008 532 663E2F30.007 659 906

A:The heat-map for dynamic of transcription factors patterns[1.5

圖3轉錄因子-DNA結合活性的改變及功能分析
Fig3ChangeofTFs-DNAbindingactivityandfunctionalanalysis

A:TFs and downstream TGs were regulated by NR2F2;B:Validation of downstream TGs by RT-qPCR;C:Validation of downstream TGs by Western blot.(1)P<0.01.

圖4NR2F2調控的下游靶基因功能分析
Fig4FunctionalanalysisofdownstreamtargetgenesregulatedbyNR2F2

多項研究表明NR2F2參與腫瘤的發生[16]。在乳腺癌中,高表達NR2F2能降低生存期,同時抑制EMT發生[17];在結直腸癌中,miR-382通過調控NR2F2表達,從而抑制細胞的生長和侵襲[18];在子宮肌瘤中和卵巢癌中,NR2F2也表達異常[19];在胃癌、食管癌中,NR2F2高表達,并與cadherin-11表達相關[20]。

綜上所述,NR2F2作為核受體家族成員之一,對多種生命活動起到重要的作用,但其具體功能及其調控的靶基因尚不明確。本研究利用本實驗室的優勢技術TOT夠快速直接篩選出顯著表達的轉錄因子;同時整合轉錄組和蛋白質組等多維蛋白質組學數據,篩選出NR2F2調控的轉錄因子及其下游靶基因;利用RT-qPCR等技術對上述潛在分子和通路進行驗證,系統闡述NR2F2的功能。本研究發現NR2F2能下調TGF-β信號通路相關的轉錄因子,抑制SMAD7的表達[21],并且與SMAD4發生相互作用,這些可能與促進腫瘤的發生相關。進一步對NR2F2調控的轉錄因子分析發現,NR2F2能調控多個免疫信號通路和細胞周期相關信號通路,后期對下游靶基因的研究也證實這一點。NF-κB信號通路參與細胞的多種生命活動,NR2F2對NF-κB的調控至關重要,可以利用刺激等手段處理細胞繼續研究NR2F2調控NF-κB信號通路的機制。NR2F2對于細胞周期的調控同時提示該分子能夠調控腫瘤細胞生長,本研究顯示其通過下調CCND3(cyclinD3)、CDKN1A(P21)及TP53等參與細胞周期相關的功能調控。此外,本研究所得數據顯示NR2F2過表達能夠顯著上調NR2F1(數據待發表)。NR2F2與NR2F1屬于同一家族成員,其結構類似,而NR2F1能夠誘導腫瘤細胞沉默[22],因此后期還可以驗證NR2F2是否通過與NR2F1協同作用共同誘導細胞周期發生改變。

我們研究孤兒受體功能的方法整合了多維蛋白質組學數據,有別于傳統生物學研究方法,對預測的可能性結果進行生物學驗證。該方法能夠快速便捷找到目標蛋白質的下游靶基因、相互作用的蛋白質及其調控的信號通路,具有廣泛的應用價值。