481例惡性腫瘤患者循環腫瘤細胞(CTC)檢測的回顧性分析

沈敏娜 戴 謙 周佳燁 王蓓麗 郭 瑋 潘柏申

(復旦大學附屬中山醫院檢驗科 上海 200032)

2012年,全球新增惡性腫瘤病例約1 410萬,死亡病例820萬[1]。相比2010年的全球癌癥統計報告,惡性腫瘤的發病率和死亡率都呈現快速上升的態勢[2]。其中,肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤的死亡率位居前列[1],通常手術切除原發腫瘤是首選治療方案,但即便是順利切除腫瘤,仍有很多患者最終死于腫瘤的復發和轉移。病理組織活檢是腫瘤診斷的金標準,但不適用于術后監測,影像學檢查適用于術后隨訪,但很難發現早期微小轉移病灶。

在原發腫瘤形成和生長的早期,循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)即可從原發腫瘤脫落,并進入血流循環,在遠處播散、種植,形成轉移灶。CTC被認為是“液體活檢”,具有實時監測功能,是一種非侵入性的新型診斷標志,有助于腫瘤微轉移的早期發現和預后評估,在治療監測及個體化治療中具有重要臨床意義[3]。

但是CTC存在于大量血細胞背景之中,在不同腫瘤之間、不同患者之間,甚至是同一患者不同時期都可能存在極大的異質性,因此分離和檢測CTC都面臨極大的技術挑戰。2004年,CellSearch系統成為FDA批準用于計數7.5 mL全血中的循環腫瘤細胞(CTC7.5)的唯一方法。第一階段使用CellSearch系統的臨床研究數據表明[4],CTC與轉移性乳腺癌、結直腸癌和去勢抵抗性前列腺癌預后不良相關。后期研究表明[5],CTC也與小細胞肺癌和非小細胞肺癌、膀胱癌、胰腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、神經內分泌腫瘤和肝細胞肝癌相關。

現有基于CellSearch平臺的文獻報道一般僅關注CTC的數量及其臨床價值,往往忽略了該平臺可以觀察到的CTC形態特征,本文以CellSearch系統為例來討論CTC的形態學特征及其臨床應用價值。

資 料 和 方 法

研究對象回顧性分析復旦大學附屬中山醫院檢驗科2014年12月至2016年4月期間申請CellSearch系統檢測CTC、經病理活檢確診并有病史資料的惡性腫瘤患者481例,包括肝癌331例、胃癌51例、結直腸癌38例、乳腺癌35例、胰腺癌17例、肺癌5例、前列腺癌4例,其中肝癌患者連續監測隨訪時間更新至2018年4月,將未發現復發、轉移或死亡的患者定義為無進展。根據CTC檢測時是否接受外科手術治療,將患者分為術前組和術后組。

檢測方法CTC檢測系統采用CellSearch系統[強生(上海)醫療器械有限公司],檢測試劑采用其配套的CTC試劑盒。使用專用的 CellSave 儲存管(添加細胞防腐劑)采集外周血并取7.5 mL全血制備樣本。將制備好的血液及緩沖液樣本放置在CellTracks AutoPrep自動化裝置中,進行細胞富集和分離,隨后進行磁孵育。將MagNest裝置富集后的CTC進行免疫熒光染色,通過CD45抗體、細胞角蛋白(CK)8,18,19抗體與細胞核DAPI熒光染色試劑共同識別CTC。CTC檢測結果經CellTracks Analyser Ⅱ系統分析后,由兩位工作人員獨立進行判讀。

統計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。 計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗,生存時間分析采用Kaplan-Meier法,生存曲線的比較采用log-rank檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

7類腫瘤術前術后CTC7.5檢出率變化術前組CTC7.5(圖1):肝癌檢出率53%,中位檢出數1(0～94)個;胃癌檢出率73%,中位檢出數2(0～42)個;結直腸癌檢出率64%,中位檢出數1(0～11)個;乳腺癌檢出率85%,中位檢出數2(0～322)個;胰腺癌檢出率62%,中位檢出數1(0～5)個;前列腺癌檢出率100%,中位檢出數32(3～35)個。術后組CTC7.5檢出率為0～37%。術前組CTC7.5檢出率居前的是前列腺癌和乳腺癌,術后組CTC7.5檢出率均有顯著下降(P均<0.05)。因術后組檢測例數過少,肺癌和前列腺癌未檢測到CTC,其他腫瘤術后組CTC7.5檢出率下降最為顯著的是乳腺癌和胃癌(χ2=9.12,P=0.003;χ2=5.76,P=0.016)。

圖1 7類腫瘤術前術后CTC7.5檢出率變化Fig 1 Preoperative and postoperative CTC7.5 detection rate in 7 types of cancer

7類腫瘤CTC的形態差異觀察7類腫瘤的CTC形態特征發現(圖2):胃癌、乳腺癌、胰腺癌多見CK強陽性CTC;肝癌、胃癌、肺癌可見體積較小CTC;不同類型腫瘤CTC形態特征存在極大異質性;同類腫瘤CTC體積、核質比、細胞形態、染色強度等亦存在較大差異,其中尤以肝癌和肺癌為甚。

圖2 7類腫瘤CTC的典型形態Fig 2 Typical cell morphology of CTC in 7 types of cancer

6例肝癌患者CTC連續監測典型形態變化6例肝癌患者CTC典型形態變化特征見圖3,CTC數量及形態特征與治療反應及預后關系見圖4。基于CTC形態變化特征將患者分為4個亞組。

圖3 肝癌患者CTC形態變化Fig 3 Morphological changes of CTC in patients with liver cancer

CTC體積變化組 治療反應及預后好。患者6連續4次監測CTC,2次檢出CTC,體積變化較大。6-a CTC細胞體積大,核質比小;6-b CTC細胞體積小,核質比大。該患者術前未檢出CTC,手術導致CTC的大量釋放,在隨后的1周內CTC7.5已大幅下降,在第1次化療后CTC已被清除,該患者目前未發現轉移復發。患者25連續3次監測CTC,2次檢出CTC,體積變化較大。25-a CTC細胞體積較小,25-b CTC細胞體積明顯增大。該患者術前CTC7.5為2個,術后1周逐漸下降為0,該患者目前未發現轉移復發。

CTC體積穩定組 治療反應不佳,CTC清除周期延長或預后不良。患者63連續5次監測CTC,3次檢出CTC,體積基本沒有變化。該患者為肝癌術后復發,CTC7.5為2個,肝移植術后降為0,但1個月后又檢出CTC,經過2次化療降為0,該患者目前未發現轉移復發。患者107連續2次監測CTC,均檢出CTC,體積無明顯變化。該患者為肝癌綜合治療后復發,CTC7.5為4個,經多次化療和TACE治療4個月后CTC7.5為7個,電話隨訪該患者復發。

CK染色增強組 CK表達增加提示預后不良[10-12]。患者99連續3次監測CTC,2次檢出CTC,體積變化不大,但第2次檢出的CTC CK染色明顯增強。該患者肝癌術后第1次化療后CTC7.5為4個,第3次化療后雖然CTC數量下降,但檢出的CTC CK染色明顯增強,第4次化療后CTC清除,但2個月后發現轉移。

CTC凋亡組 預后良好。患者134連續3次監測CTC,2次檢出CTC,形態變化明顯,第2次檢出的CTC可見碎裂的CK呈小圓囊泡狀環繞核周,說明這些細胞正在走向凋亡。該患者肝移植術后18天CTC7.52個,第1次化療后CTC7.5仍為2個,但觀察第2次檢出的CTC發現細胞正在走向凋亡,該患者目前未發現轉移復發。

不同亞組CTC患者無進展生存曲線比較Kaplan-Meier生存分析表明,CTC體積穩定組(n=11)的無進展生存率顯著低于CTC體積變化組(n=9)(27.3%vs.77.8%,P=0.0405,圖5A);CK染色增強組(n=8)的無進展生存率顯著低于無CK染色增強組(n=18)(0vs.88.9%,P<0.000 1,圖5B);無CTC凋亡組(n=18)的無進展生存率顯著低于CTC凋亡組(n=4)(16.7%vs.100.0%,P=0.009 6,圖5C)。以上結果提示以CTC形態特征為基礎的CTC亞組(包括CTC體積變化、CK染色增強、CTC凋亡)可能與肝癌患者的臨床預后相關。

討 論

CTC作為“液體活檢”標志用于腫瘤患者實時動態監測。隨著分離、富集和檢測技術的發展,已有多種平臺可用于檢測外周血中的CTC。由于無法進行標準化,不同平臺CTC報道的數量變化范圍很大,本文回顧性分析的數據也顯示CellSearch系統的CTC檢出率確實與其他平臺報道的數據有一定差異[4,6-7]。

No recurrence:Patient 6,25,63 and 134;Metastasis:Patient 99;Recurrence:Patient 107.

圖4肝癌患者治療反應CTC連續監測
Fig4CTCdetectionoftreatmentresponsesurveillanceinpatientswithlivercancer

圖5 不同亞組CTC患者的無進展生存曲線Fig 5 Progression-free survival curve of different CTC subgroups

CellSearch系統是唯一被FDA批準用于臨床檢測轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌患者外周血CTCs[8]的檢測平臺,CellSearch系統由專用的CellSave儲存管、血樣處理設備 AutoPrep系統、掃描和分析樣本的Analyzer系統以及配套的試劑盒等部分組成,是目前國際上最為穩定和可靠的CTC檢測系統。AutoPrep系統能夠實現復雜樣本處理流程的自動化和標準化。Analyzer系統是一種熒光光學系統,可對經過免疫磁性分選的CTC進行全自動掃描,并進行全自動背景分析,以圖庫形式呈現備選的熒光檢測圖像,最終經人工判讀確定CTC報告數量。

目前CellSearch系統定義一個CTC的基本條件需要有細胞核(DAPI染色陽性)、CK+、CD45-(排除白細胞背景干擾)、面積大于4 μm×4 μm,具有細胞形態和免疫學特征。但當著眼于CTC的形態特征時,發現腫瘤患者自身和不同患者之間,CTC都具有很大的異質性[4]。不同腫瘤之間CTC的形態差異也很大,例如胃癌、乳腺癌、胰腺癌多見大體積、CK染色強陽性CTC,結直腸癌、前列腺癌也多見大體積CTC;而肝癌、肺癌多見小體積CTC,且細胞形態異質性程度更高。根據我們觀察CTC細胞形態的經驗,在判定不同腫瘤或不同患者CTC時,即使滿足CellSearch系統CTC的基本定義,CTC形態的異質性仍會給判讀造成一定困難。因此,即便使用相同的CellSearch系統,由于沒有指南明確規定詳細的CTC判讀標準,加之判讀人員對形態的理解、認知、經驗等方面的差異,不同實驗室CTC報告數量仍可能存在一定差異。CellSearch系統雖然只報告CTC數量,但人工判讀部分完全基于細胞形態特征,因此我們對于細胞形態的探討有助于積累更多的經驗,減少判讀差異,以期最終形成統一的判讀標準。

基于CellSearch系統,通常認為CTC數量與預后相關,CTC數量越多,預后越差[7,9]。在肝癌患者治療監測過程中,我們發現同一患者的CTC形態也是不斷變化的,而且這種變化可能與治療反應及預后密切相關。我們連續監測肝癌患者的CTC形態變化,發現CTC體積變化、CK染色增強、凋亡CTC的出現可能與肝癌患者的治療反應及臨床預后相關。本文隨訪數據顯示,若治療過程中,肝癌患者CTC體積發生明顯變化,提示治療可能有效;反之,則提示CTC對治療反應不佳,清除CTC的周期延長,甚至預后不良。鑒于隨訪患者數量有限,該現象還需要進一步擴大隨訪例數進行驗證。細胞角蛋白19 (cytokeratin 19,CK19)是膽管細胞和肝祖細胞的標志物,與肝癌患者的預后不良密切相關[10-11]。近期研究發現,CK19的表達與上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的表達相比,與腫瘤侵襲更具有相關性[12]。CTC CK染色增強可能強烈提示預后不良,其預后價值不亞于CTC數量。凋亡CTC的出現提示CTC即將被清除[4],在我們的研究中多見于肝移植術后患者,即使CTC數量未下降,凋亡CTC的出現也提示預后良好。

我們通過Kaplan-Meier生存分析,比較不同亞組CTC患者無進展生存率,CTC體積穩定組、CK染色增強組、無CTC凋亡組的無進展生存率均顯著低于CTC體積變化組、無CK染色增強組、CTC凋亡組。進一步驗證了以CTC形態特征為基礎的CTC亞組(包括CTC體積變化、CK染色增強、CTC凋亡)可能與肝癌患者的臨床預后相關。有效的治療不僅使CTC數量下降,也可能使CTC形態發生一定的改變。我們報告CTC數量的同時,若能兼顧CTC形態的變化,可以給臨床提供更多監測數據,有助于臨床醫師更準確地判斷治療效果并及時調整治療方案,以期改善預后。同時,CTC形態特征變化對臨床預后可能有一定的提示作用。當然,局限于本文連續監測CTC且能觀察到CTC形態變化的患者例數有限,還需要進一步擴大數據,進行驗證。