繼發性甲狀旁腺功能亢進癥患者FGFR1與Klotho蛋白在不同增生類型甲狀旁腺組織中的表達及其意義

孫學明 孔維信 陸 藝 吳起嵩 朱小東

(1江蘇大學附屬昆山醫院老年醫學科 昆山 215300; 2上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院 蘇州 215021;3東部戰區總醫院國家腎臟病臨床醫學研究中心 南京 210016)

成纖維細胞生長因子-23(fibroblast growth factor-23,FGF-23)是一種重要的磷代謝調節因子,通過與甲狀旁腺細胞FGFR1-Klotho蛋白結合,直接抑制血清全段甲狀旁腺激素(intact parathyroid hormone,iPTH)的分泌及基因的表達。繼發性甲狀旁腺功能亢進癥(secondary hyperparathyroidism,SHPT)患者血清中FGF-23、iPTH水平均顯著升高,FGF-23、iPTH代謝異常表現為血、尿磷排泄異常,甲狀旁腺功能亢進,佝僂病、骨軟化等[1-2]。甲狀旁腺組織特征性病理性改變表現為甲狀旁腺細胞彌漫性和結節性增生,其中結節性增生患者臨床進展較快,預后相對于彌漫性增生患者差。目前,相關病因研究取得了一定進展,但是,甲狀旁腺細胞不同病理性增生的確切機制尚不清楚。

Klotho蛋白作為FGF-23重要的輔助因子,抑制腎臟對磷酸鹽的重吸收,促進尿磷排泄發揮重要作用。Klotho基因最早由日本學者Kuro-o等[2]在研究自發性高血壓時發現,近年來研究證明Klotho具有廣泛和重要的生物學作用。Klotho在腎臟的遠曲小管、甲狀旁腺細胞等組織細胞表達,動物模型研究發現FGF-23與Klotho基因敲除小鼠具有相似的臨床表型[2-3]。進一步的研究表明,Klotho在調控機體磷代謝中也起到重要作用,FGF23-Klotho軸影響甲狀旁腺素(parathyroidhormone,PTH)的合成與分泌是CKD骨礦物質代謝紊亂(CKD-mineral and bone disorder,CKD-MBD)的發病機制之一。目前有研究指出Klotho可作為腎損傷的標志物之一及腎臟損傷預后指標,FGF-23需與其受體FGFR1結合方能發揮作用,Klotho可促進兩者的結合,FGF-23、FGFR1、Klotho三者相互作用影響甲狀腺功能,然而三者之間的消長關系及與甲狀腺增生病理表現的關系有待進一步深入研究。本研究擬通過測定SHPT患者術前、術后FGF-23水平及其受體FGFR1與Klotho蛋白質在不同增生類型甲狀旁腺組織中的表達差異,應用甲狀腺組織病理學及電鏡超微病理學方法進行對比觀察,進一步證實FGF-23、FGFR1及Klotho表達水平與甲狀腺組織增生病理性表現的相關性,同時擬通過對術后相關指標檢測進一步評價現行甲狀旁腺切除手術對繼發性甲狀旁腺功能亢進癥患者的治療價值。

資 料 和 方 法

研究對象選擇2015年1月至2016年10月在蘇州九龍醫院腎內科住院的SHPT患者。入組標準:(1)年齡大于18周歲的血液透析患者;(2)近1個月病情穩定;(3)至少規律透析3個月以上。排除標準:(1)近1個月內發生急性感染;(2)合并晚期惡性腫瘤;(3)一般情況差,預期生存期不足1年。共入選SHPT患者25例,其中男性11例,女性14例。原發病為慢性腎小球腎炎14 例,高血壓病5例,糖尿病5例,成人型多囊腎1例。以同期內該院體檢中心的健康志愿者10例作為對照組,其中男5例,女5例,排除慢性腎臟病、腫瘤和急慢性感染。

研究方法治療組患者于透析當日空腹在動脈端取血,對照組于清晨空腹采肘靜脈血。分別檢測治療組和對照組血清iPTH、FGF-23、Klotho、血磷水平,對治療組行甲狀旁腺切除手術,對摘除的甲狀旁腺進行稱重,檢測治療組患者術后血磷水平、術后48 h FGF-23和iPTH水平。

依據術中所見,將甲狀旁腺增生參差明顯的患者作為亞組進行分析,即將甲狀旁腺組織分為無明顯增生組(單個甲狀旁腺最長徑<15 mm)、彌漫性增生組(單個甲狀旁腺長徑≥15 mm,且未捫及結節)和結節性增生組(甲狀旁腺組織中可捫及結節)3個亞組。結果顯示,所有SHPT患者均存在彌漫性增生或結節性增生,有2例患者同時存在彌漫性增生和結節性增生。依據上述分組標準,最終有37 份組織被獲取并納入亞組分析。采用實時定量熒光real-time PCR法檢測甲狀旁腺組織中FGFR1 mRNA、KLotho mRNA的表達,采用Western blot法檢測甲狀旁腺組織中的FGFR1及Klotho水平。

實時定量熒光real-time PCR法檢測甲狀旁腺組織中FGFR1 mRNA及KLotho mRNA的表達利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線實現對起始模板(FGFR1 mRNA、KLotho mRNA)的定量分析。操作過程共分為總RNA提取、逆轉錄、實時定量PCR 3個步驟。

Western blot法檢測甲狀旁腺組織中的FGFR1及Klotho水平 將電泳分離后的蛋白質(FGFR1、Klotho)從凝膠轉移到固相支持物PVDF膜上,然后用ESL底物進行化學發光檢測、X光片曝光,經顯影定影處理后,膠片用掃描儀掃描,使用Gel-Pro analyzer軟件進行灰度分析定量。

采用光鏡及電鏡觀察不同亞組甲狀旁腺組織改變。

結 果

研究對象臨床特征25例SHPT患者,平均年齡(47.2±6.4)歲,透析齡(52.2±12.3)個月。10例對照組健康志愿者,平均年齡(45.7±9.6)歲。

患者血清FGF-23、Klotho和血磷水平的相關分析采用獨立樣本的t檢驗分析數據。患者血清FGF-23水平為(1 352.44±390.84)pg/mL,明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.01);患者血清Klotho水平為(12.16±2.12)pg/mL,明顯低于同年齡對照組,差異有統計學意義(P<0.01);患者血磷水平(2.30±0.59)mmol/L,明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.01,表1)。

全切的甲狀旁腺組織質量與術前iPTH的相關分析采用雙變量相關分析求得Pearson相關系數分析數據。每一位接受甲狀旁腺切除的患者被切除甲狀旁腺組織的總質量,其中包括無明顯增生(n=10)、彌漫性增生(n=15)和結節性增生(n=12)的甲狀旁腺組織,與患者術前血清全段甲狀旁腺激素(intact parathyroid hormone,iPTH)呈正相關,(r=0.623,P=0.001,圖1)。

術后48h患者iPTH水平、FGF-23水平、血磷水平與術前的比較采用配對樣本的t檢驗分析數據。術后48 h患者血清iPTH (75.12±32.92)pg/mL較術前明顯下降,差異有統計學意義(P<0.01);術后48 h患者血清FGF-23水平(1 289.05±356.71) pg/mL,與術前相比無明顯下降,差異無統計學意義(P=0.13);術后48 h患者血磷(1.56±0.40)mmol/L,與術前相比明顯下降,差異有統計學意義(P<0.01,表2)。

表 1 治療組與對照組指標匯總表Tab 1 Summary of indicators in treatment group and control group ±s)

(1)Compared with the control group,P<0.01.

圖1 甲狀旁腺組織質量與iPTH相關關系散點圖Fig 1 Correlation of parathyroid tissue weight with preoperative iPTH

±s)

Compared with before operation,(1)P=0.13,(2)P<0.01.

1:No obvious hyperplasia group;2:Nodular hyperplasia group;3:Diffuse hyperplasia group.

圖2不同增生程度甲狀旁腺組織中Klotho和FGFR1電泳圖
Fig2ElectrophoretogramaboutKlothoandFGFR1in
parathyroidglandsofdifferenthyperplasiadegrees

不同類型增生甲狀旁腺組織中Klotho、FGFR1蛋白及KlothomRNA、FGFR1mRNA的比較采用獨立樣本的t檢驗分析數據。無明顯增生組的甲狀旁腺中的Klotho水平最高,為0.862 5±0.230 4;彌漫性增生組甲狀旁腺中的Klotho水平高于結節性增生組,差異有統計學意義(P<0.05,表3);無明顯增生組的甲狀旁腺中的FGFR1水平最高,為0.816 3±0.124 2,彌漫性增生組的甲狀旁腺中的FGFR1水平高于結節性增生組,差異有統計學意義(P<0.05,表3)。

無明顯增生組的甲狀旁腺中的Klotho mRNA水平和FGFR1 mRNA水平分別與彌漫性增生組和結節性增生組三者之間兩兩比較,差異無顯著性意義(圖2,表3)。

不同增生甲狀旁腺組織的光鏡形態正常甲狀旁腺組織中含有3種細胞,分別為主細胞、嗜酸性細胞和透明細胞,主細胞是主要的實質細胞。甲狀旁腺的不同類型增生實質是3種細胞從有序到無序增生的過程。在無明顯增生組中,細胞較一致,實質細胞主要由主細胞、水樣透明細胞和嗜酸性細胞組成,間質有毛細血管,實質細胞與間質脂肪比例相等(圖3A)。彌漫性增生組中,細胞排列緊密,增生的細胞主要為主細胞而很少嗜酸細胞,間質有少量或沒有脂肪(圖3B)。而結節性(腺瘤性)增生組中,由各種細胞組成,細胞排列在纖細毛細血管網周圍,偶有分葉或結節狀,可見小囊,內含不等量膠樣物質,間質中無脂肪(圖3C)。

不同增生組織的電鏡形態甲狀旁腺實質由密集的細胞團組成,與無明顯增生組相比,彌漫性增生組中增生的細胞以主細胞為主,大部分主細胞處于活躍的分泌狀態,細胞內可見大量的線粒體,豐富的粗面內質網,高爾基復合體發達,高爾基小泡及核糖體多沿液泡周圍分布。胞質內見較多分泌顆粒和糖原顆粒,嗜酸性細胞增多。隨著增生程度的加重,結節性增生組細胞呈巢狀排列,結構趨于紊亂,胞質內見較多的粗面內質網,其他細胞器明顯減少,線粒體腫脹、空泡變性或嵴有異常,部分細胞壞死改變(圖4)。

表3 分組檢測甲狀旁腺組織相關指標Tab 3 Indexes related to packet detection of different parathyroid tissues (n,±s)

aThere are 37 parathyroid tissues in 25 cases.Compared with no obvious hyperplasia group,(1)P<0.05.

A:No obvious hyperplasia group;B:Diffuse hyperplasia group;C:Nodular hyperplasia group.

圖3不同增生類型甲狀旁腺組織的光鏡形態(HE,×40)
Fig3Lightmicroscopyofdifferenttypesofhyperplasticparathyroidtissues(HE,×40)

A:No obvious hyperplasia group;B:Diffuse hyperplasia group;C:Nodular hyperplasia group.

圖4不同增生組織的電鏡形態
Fig4Electronmicroscopicmorphologyofdifferenthyperplastictissues

討 論

FGF-23是成纖維細胞生長因子家族的成員,是一種由骨細胞和成骨細胞合成的具有內分泌功能的蛋白質,由251個氨基酸組成,相對分子質量為26 000[4]。FGF受體屬于酪氨酸激酶型受體,目前發現的共有5種,即FGFR 1～5。FGFR1是FGF-23在腎臟的主要受體,Klotho蛋白質可直接與FGFR1結合。生理情況下,FGF-23作用于甲狀旁腺的受體FGFR1和共受體Klotho,抑制甲狀旁腺激素的分泌,維持鈣磷穩態[5]。FGF-23與Klotho-FGFR1復合物的親和力遠高于單獨的FGFR1,因此FGF-23需要Klotho的協助才能發揮作用[6]。在慢性腎功能衰竭合并SHPT時,因腎單位減少導致磷排泄不足,Klotho表達下降,兩方面因素導致FGF-23的功能不能充分發揮[7],血清FGF-23代償性增加。本研究對慢性腎功能衰竭繼發性甲狀旁腺功能亢進癥擬行甲狀旁腺切除手術患者手術前血清全段甲狀旁腺激素、FGF-23和Klotho蛋白質、血磷水平等指標進行了橫向分析,檢測結果表明患者血清的PTH、FGF-23和血磷水平均明顯高于健康人群。居高不下的FGF-23水平卻不能下調PTH水平,分析原因考慮與Klotho蛋白質水平低下密切相關。Klotho在慢性腎功能衰竭合并繼發性甲狀旁腺功能亢進癥血清中的低表達,直接導致Klotho蛋白質與FGFR1可結合數量下降,FGF-23不能有效抑制甲狀旁腺激素的分泌,即甲狀旁腺細胞對FGF-23的產生了抵抗。亞組分析顯示,結節性增生患者甲狀旁腺組織中的Klotho和FGFRl水平更低,相應的情況也就更糟。

本研究結果顯示切除甲狀旁腺組織的總質量與血清全段甲狀旁腺激素中等程度相關,有益于外科手術術前評估;術后48 h患者血清iPTH明顯下降,而血清FGF-23水平尚無明顯變化,患者血清磷水平卻已降至正常,印證了血清iPTH是直接的調磷激素。

本研究對甲狀旁腺增生參差明顯的患者甲狀旁腺進行亞組分析,比較其在光鏡及電鏡下的異同。我們發現,無明顯增生組甲狀旁腺組織在光鏡和電鏡下表現一致,均為主細胞、大細胞、嗜酸性粒細胞和移行細胞,且這些腺體細胞的特點是形狀和尺寸一致[8]。在光鏡下,彌漫性增生組和結節性增生組形態基本相同,均可見較多的主細胞、較少的嗜酸細胞增生。而在電鏡下,彌漫性增生組和結節性增生組形態則有明顯差異,具體表現為彌漫性增生組細胞中可見大量的線粒體,豐富的粗面內質網,高爾基體復合體發達,主細胞處于活躍的分泌狀態;而結節性增生組細胞中的細胞呈巢狀排列,結構趨于紊亂。簡言之,結節性增生甲狀旁腺組織中明顯正常大小的腺體為低活性狀態[9]。本研究所入組的患者行甲狀旁腺切除的目的是為了從去除甲狀旁腺激素產生的源頭,阻斷鈣磷代謝諸多環節中最重要的一環,所以在除外惡性腫瘤情況下,術后甲狀旁腺病理類型似乎不具有重大意義。通過對光鏡和電鏡的對比分析,我們認為宏觀大體標本的形態質地對甲狀旁腺增生判定有一定的誤差,采取常規光鏡檢查顯示腺體的大小形態,同時電鏡觀察甲狀旁腺主細胞的功能狀態,方能最終診斷或否定結節樣增生[10]。

本研究發現:無明顯增生的甲狀旁腺組織中的Klotho和FGFRl水平略高,與彌漫性增生患者相比,結節性增生患者甲狀旁腺組織中的Klotho和FGFRl水平最低。提示與正常甲狀旁腺相比,增生的甲狀旁腺Klotho蛋白表達顯著減少,且隨著甲狀旁腺病理程度的進展而進一步下降,與文獻一致[11]。如電鏡所見,彌漫性增生組和結節性增生組均可見較多主細胞,兩者的不同點在于結節性增生組甲狀旁腺主細胞雖多但活性低,趨向無功能。正常情況下,甲狀旁腺主細胞分泌PTH,成骨細胞分泌FGF23,借助Klotho的協助,FGF23與甲狀旁腺細胞表面的FGFR1結合,發揮其調節鈣磷代謝的正常生理作用,可以說此時FGF23和PTH是低水平的互為消長的狀態。對于SHPT患者,該平衡被打破,腎臟排磷障礙、血磷進行性升高觸發甲狀旁腺主細胞增生以分泌更多的PTH,同時高磷刺激成骨細胞分泌更多的FGF23,由于高磷、低活性維生素D、低血鈣持續存在,FGF23與PTH之間的對抗不斷升級,甲狀旁腺和全身骨骼系統隨之發生一系列變化,甲狀旁腺機能亢進、骨質疏松接踵而至,相對于骨骼系統,甲狀旁腺中發生的變化因集中而明顯。我們觀察到,隨著甲狀旁腺增生的進展,Klotho和FGFRl水平呈進行性下降趨勢,不同增生程度的甲狀旁腺組織中的Klotho mRNA和FGFR1 mRNA水平無顯著差異。目前我們的研究尚無法從機制上清晰地闡明這一切發生的因果或先后順序。FGFRl和Klotho表達降低導致FGF-23通過MAPK通路直接作用于甲狀旁腺,使之降低PTH的作用受阻,反饋刺激產生更高水平的FGF-23來代償維持機體的平衡[12]。我們的研究證實,甲狀旁腺組織中Klotho表達水平可能是導致SHPT患者甲狀旁腺呈不同增生方式的重要原因,與文獻結論一致[13]。

電鏡下3個亞組比較,彌漫性增生組細胞中主細胞最活躍,Koltho和FGFRl水平卻在結節性增生組最低,說明SHPT患者甲狀旁腺中Koltho表達水平與主細胞功能不存在直接的線性關系,此現象與我們所熟知的Klotho在腎臟的遠曲小管和甲狀旁腺細胞等組織細胞表達這一經典理論有所不同。我們認為甲狀旁腺細胞在增生過程中除了分泌甲狀旁腺激素之外,其他內分泌功能的缺失是主要原因,Koltho和FGFRl表達水平的下降是結果而不是原因,隨著病情的進展,細胞間接觸抑制功能缺失,從彌漫增生到結節增生,甚至甲狀旁腺惡性腫瘤隨之而來。引起SHPT患者甲狀旁腺中Koltho和FGFRl表達水平下降的其他可能原因還有血磷和FGF23的調節、循環Klotho的負反饋等。我們認為,甲狀旁腺組織中Klotho表達水平高低與甲狀旁腺的增生方式有密切關聯,Klotho表達水平越低越傾向于結節性增生。

總之,慢性腎功能衰竭合并繼發性甲狀旁腺功能亢進癥,合并高磷血癥時,甲狀旁腺切除手術可以有效地控制病情,改善鈣磷代謝[14-15]。增生的甲狀旁腺組織中Klotho蛋白質表達顯著減少,過低的Klotho蛋白質直接決定了甲狀旁腺組織繼續增生的方式方向。不同增生程度的甲狀旁腺對相關生化指標的貢獻明顯不同,結節增生的甲狀旁腺決定了患者FGF-23和Klotho的水平,為了及時地干預病程,當患者存在嚴重鈣磷代謝紊亂,體檢或超聲可證實存在結節樣增生時,患者甲狀旁腺增生、甲狀旁腺激素升高、FGF-23代償性升高、甲狀旁腺組織中的Klotho和FGFRl水平下調,FGF-23水平明顯升高,甲狀旁腺細胞對FGF-23的抵抗加劇,甲狀旁腺激素升高,腎功能進一步惡化等情況。為打斷上述惡性循環,應動員患者盡早接受治療,通過甲狀旁腺切除手術可有效降低血清iPTH水平,改善鈣磷代謝,從而改善整體狀況。若條件允許,可對術后甲狀旁腺組織行常規病理光鏡和電鏡檢查,以更準確地判斷增生的性質,為下一步的科學治療奠定基礎。