一種改良的小鼠誘導多功能干細胞(iPS)向樹突狀細胞(DC)分化的方法

張 琦 侯劍剛

(1復旦大學附屬華山醫院皮膚科,2泌尿外科 上海 200040)

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)于1973 年由Steinman首次發現,因其細胞膜向外伸出,有類似的膜性樹狀突起,故被命名為DC[1]。它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原,未成熟狀態下的DC具有較強的遷移能力,成熟狀態下的DC能有效激活初始型T細胞,處于啟動、調控、維持免疫應答的中心環節,在腫瘤免疫、抗感染免疫、免疫排斥等方面發揮著重要作用。

DC表面沒有單一的、特異性的分子標志,而且不同種屬、不同發育階段、不同亞群的DC 形態不盡相同[2]。正常情況下,絕大多數的髓系DC在體內都處于未成熟狀態,未成熟DC表達低水平的協同刺激分子(如CD40、CD80、CD86等),主要功能為識別、攝取和處理抗原;當未成熟DC在接受外源性抗原、炎性刺激等因素刺激后逐漸成熟,成熟DC表達高水平的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ、MHC Ⅱ類分子、協同刺激分子等,并能激活原始T淋巴細胞活化增殖,啟動細胞介導的適應性免疫應答[3]。

盡管DC廣泛分布于腦以外的全身組織和臟器,但是數量較少,因此在體外培養及擴增DC中至關重要[3]。Inaba等[4]在1992年首次報道粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating fagtor,GM-CSF)及IL-4聯合誘導骨髓細胞分化DC;Senjo等[5-6]在2003年及2009年分別報道了小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell,ES)及小鼠誘導多功能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPS)向DC分化的誘導方法,其中iPS細胞向DC誘導的方法總體需要28天。

本研究借鑒了Senjo的三段誘導模式,通過改良培養過程中op9細胞的處理方式,將iPS向DC誘導的過程縮短至17天。本研究結果將為利用iPS細胞來源DC(iPS-DC)進行免疫治療研究提供基礎。

材 料 和 方 法

主要試劑與儀器胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、MEM-α培養基、RPMI1640培養基、2-巰基乙醇(2-ME)、青鏈雙抗(P/S)、非必需氨基酸(NEAA)購自美國Gibco公司;白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)、絲裂霉素C(mitomycin-C,MMC)、細菌脂多糖(lipopo-lysaccharide,LPS)、甲醇及吉姆薩染劑購自美國Sigma公司;GM-CSF、重組IL-4購自美國Peprotech公司;抗小鼠CD309、CD34單克隆抗體及其同型對照抗體購自美國eBioscience公司,抗小鼠 CD45、CD11b、CD11c、CD40、CD80、CD86、IA/IE單克隆抗體及其對照抗體購自美國Biolegend公司。FITC-OVA及FITC-dextran購自美國Sigma公司;Violet增殖染劑450購自美國BD公司。T細胞分選尼龍購自日本和光純藥工業株式會社。倒置相差顯微鏡購自日本Olympus 公司;GalliosH流式細胞儀購自美國Beckman公司;細胞離心涂片機購自美國ThermoFisher公司。

iPS細胞培養小鼠iPS細胞系(iPS-MEF-Ng-38C-2,H-2kb/d)為日本京都大學Yamanaka教授贈予。iPS 細胞的培養液為含20% FBS及1 000 U/mL LIF的DMEM。用于iPS細胞維持培養的飼養層細胞為MMC處理的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast cell,MEF)。

op9細胞培養op9細胞株是小鼠頭蓋骨骨髓基質細胞,由日本熊本大學Senjo教授贈予。op9細胞培養液是含20%FBS的MEM-α。

iPS細胞向樹突狀細胞分化誘導iPS細胞向DC的分化分為3個階段。在第1階段開始之前需要分別準備小鼠iPS細胞和op9細胞,步驟如下:3天前將5×105個MEF細胞復蘇至明膠鋪底的培養皿(直徑6 cm)上,隔日在MEF細胞上種植1×105個iPS細胞;2天前將5×105個op9細胞種植在明膠鋪底的培養皿(直徑10 cm)上。第1階段的分化開始這一天計時為D0,步驟如下:為了純化iPS細胞,將0.25%胰蛋白酶消化后得到的iPS細胞與MEF細胞混合物用iPS培養液重置,利用兩種細胞沉降速度不同的特點,室溫靜置30 min后取上層1/3細胞,顯微鏡下計數,計算iPS細胞占比,當iPS細胞占比大于90%時可以使用,不足90%則重復上述沉降分離操作。由于MEF為經MMC處理的失活細胞,所以殘留的少數MEF細胞在下一步與op9細胞混合培養的過程中會死亡并漂浮到培養液里,不會影響實驗結果。接下來將所得到的1×105個iPS細胞種植于3天前準備好的op9細胞上,本階段的培養液為op9培養液,每皿10 mL。3天后(D3),每皿去除5 mL原培養液,加入5 mL新鮮培養液,約4天后(D7),細胞團變成扁平盤狀時可以判斷為第1階段完成,此時去除全部培養液,經0.25%胰酶消化后進入下一階段。第2階段:第1階段收集的細胞(iPS分化細胞與op9細胞混合物)平分至3個明膠鋪底的培養皿(直徑10 cm),本階段培養液為添加GM-CSF (10 ng/mL) 和 2-ME (50 mmol/L)的op9培養液,每皿10 mL,經過3天的培養(D10),培養液中可見大量浮游細胞,即可判斷為細胞達到了第2階段應該實現的狀態,此時輕輕吹打收集這些細胞進入第3階段。第3階段:為了進一步去除黏附細胞,將第2階段得到的細胞按每皿2×106個種于培養皿(直徑10 cm)里,培養液為含10%FBS、GM-CSF(10 ng/mL)和IL-4 (10 ng/mL)的RPMI-1640;2天后(D12)收集細胞轉移至低黏附的24孔板中,每孔1×106個,培養液同前,繼續培養3天后(D15),加入LPS (1 μg/mL)進行成熟刺激,2天后(D17)細胞出現樹突狀形態時,收集細胞完成培養。

骨髓細胞向DC分化的誘導取與iPS細胞同系的B6D2F1小鼠股骨及脛骨骨髓細胞,去除紅細胞后按每孔2×106個種于24孔板,計時為D0,培養液為含10%FBS、GM-CSF (10 ng/mL)和IL-4 (10 ng/mL)的RPMI-1640,每孔1 mL,2天后(D2)輕輕敲打培養板壁,去除浮游細胞,每孔加入5 mL原培養液和5 mL新鮮培養液,繼續培養3天(D5),加入LPS (1 μg/mL)進行成熟刺激,2天后(D7)收集細胞完成培養。

細胞離心涂片及染色為了更好地觀察iPS-DC,將D17的iPS-DC用含10%FBS的RPMI-1640重置,取100 μL(含1×104個細胞),436×g離心10 min,將細胞轉移至載玻片上,甲醇固定 2 min后滴加吉姆薩染色液,室溫染色20 min后用自來水緩慢從載玻片一端沖洗5 min,晾干后于倒置顯微鏡下觀察。

流式細胞術檢測收集待測細胞放置于PBS中,加入待測抗體(APC-CD309、PE-CD34、FITC-CD45、FITC-CD11b、PE-CD11c、APC-CD40、APC-CD80、APC-CD86及APC-IA/IE),4 ℃冰箱中避光放置20 min,PBS清洗2次,每管待測細胞中保留100 μL PBS,流式細胞儀上機檢測,獲得數據采用Flowjo軟件進行分析。

淋巴細胞混合培養C57BL/6 小鼠的脾臟T淋巴細胞以T細胞尼龍分離法分離后,經Violet增殖染劑450 染色,用作應答細胞。骨髓來源DC (BM-DC)和iPS-DC分別作為刺激細胞。DC細胞數量分別為1.25×104、5×104、1×105和2×105個,T細胞數量為2×105個,應答細胞與刺激細胞混合后置于圓底96孔板中,37 ℃、5%CO2培養箱中培養4天,收集細胞,PBS清洗后流式細胞儀上機檢測,獲得數據采用Flowjo軟件進行分析。

結 果

iPS-DC形態培養初始階段將培養皿直接置于倒置顯微鏡下,發現iPS細胞在形態上與ES細胞相近(圖1A),進入第1階段后iPS細胞團在op9細胞上逐漸分化,7天后細胞團在形態上呈現出扁平細胞團狀(圖1B);進入第2階段,可以看到逐漸增多的體積小的圓形細胞從細胞團中分離出來浮游在培養液中(圖1C);第3階段培養過程中細胞逐漸增大并呈現出典型的毛刺狀(圖1D),此時得到的是未成熟DC(immature DC,iDC);加入LPS刺激后得到成熟DC(mature DC,mDC)(圖1E);收集細胞,經離心、涂片、固定后,以吉姆薩染色,可見清晰的樹突狀形態(圖1F)。

iPS-DC表型檢測隨著培養的進展,iPS分化的細胞在第2階段的第3天(D10)顯現出造血干細胞的特征性表面分子標志CD309和CD34;在第3階段的第5天(D15)表現為造血干細胞的分子標志CD309和CD34表達減少,而代表白細胞的細胞表面分子標志CD45表達升高,同時代表DC的特征性表面分子標志CD11b與CD11c的表達也升高(圖2)。

以表達雙陽性CD11b/CD11c分子的細胞集團為確定DC的標準,與BM-DC相比,誘導得到的iPS-DC在純度上要高于BM-DC (圖3)。

A:iPS cell;B:Step 1 D7;C:Step 2 D10;D:Step 3 D17,culture without LPS stimulation;E:Step 3 D17,mature DCs stimulated by LPS;F:Step 3 D17,mature DCs after the cytospin procedure and staining with May-Grunwald-Giemsa.

圖1分化各階段細胞的形態圖像
Fig1ThemorphologyoftheiPS-DCsduringthecultureof3steps

圖2流式細胞術檢測iPS細胞向DC誘導過程中
細胞表面分子的表達變化
Fig2TheexpressionofsurfacemoleculeofiPS
generatedDCsdetectedbyFCM

培養后得到的未成熟iPS-iDC弱表達第一信號MHCⅡ分子及第二信號CD40、CD80和CD86分子,經過LPS刺激后得到的iPS-mDC上的MHCⅡ分子及CD40、CD80和CD86分子的表達均增高,與這些分子在BM-mDC上的表達近似(圖4)。

iPS-DC抗原吞噬能力的檢測未經LPS刺激的未成熟的iPS細胞來源的DC (iPS-iDC)對于2種抗原(OVA和Dextran)具有很強的吞噬能力,這符合iDC的特點;而經過LPS刺激后的iPS-mDC對于OVA和Dextran的吞噬能力均下降,這與BM-mDC相似并符合mDC的特點(圖5)。

iPS-DC刺激同種異體T淋巴細胞增殖能力的檢測iPS-mDC與BM-mDC一樣,具備激活同種異體T淋巴細胞增殖的能力,且激活能力與細胞數量成正比(圖6)。

圖3 培養完成時iPS-DC表達CD11b/CD11c雙陽性分子的細胞比例高于BM-DCFig 3 The ratio of molecule expression of double positive CD11b and CD11c on the iPS-DC was higher than which on the BM-DC at the end of the culture

圖4培養完成時iPS-DC細胞表面分子
表達與BM-DC近似
Fig4ThesurfacemoleculesexpressionontheiPS-DC
attheendofthecultureweresimilarwithBM-DC

圖5iPS-DC具有抗原吞噬能力
Fig5AntigenuptakeanalysisofiPS-DC

圖6iPS-DC具有刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力
Fig6ProliferationofallogenicT-cellsstimulatedbyiPS-DC

討 論

DC是目前所發現的功能最強大,可控制一系列免疫應答且高度特異化的抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC),其可調動多種免疫抵抗機制,并且是體內唯一能夠激活初始T細胞進而發揮抗感染、抗腫瘤等免疫效應的APC[2]。1992年Inaba等[4]研究首次發現骨髓細胞或者外周血單個核細胞可以在GM-CSF和IL-4的聯合刺激下誘導分化成DC,這一發現開啟了利用DC進行免疫治療的大門。

Senjo等[5-6]在2003年及2009年分別報道了小鼠ES細胞及iPS細胞向DC分化的誘導方法,其中小鼠iPS細胞向DC誘導的方法總體需要28天。本研究在誘導小鼠iPS向DC分化的過程中發現,通過改變對第2階段中op9細胞的使用方式可以縮短分化誘導的時間,并獲得形態、表型及功能均具備DC特征的iPS-DC。

op9細胞是一種骨髓基質細胞,來源于巨噬細胞刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)缺陷小鼠。op9細胞作為飼養層細胞可用于ES細胞誘導粒細胞、紅細胞、B淋巴細胞等多種造血細胞[8]。DC同其他白細胞一樣都是來源于骨髓中的造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSC)[7],因此本研究與Senjo等[6]一樣也選擇了op9細胞作為誘導iPS向HSC分化的飼養層細胞。對于誘導第2階段的op9細胞的處理方式,本研究與文獻不同:Senjo等[6]重新準備了新鮮的op9細胞用作第2階段的飼養層細胞,而本研究重復利用了第1階段的op9細胞,直接將第1階段iPS分化的細胞與op9細胞的混合物一起傳代種植到了新的培養皿中。本研究發現重復利用的op9細胞不但完全可以成為第2階段的飼養層細胞,更加快了整個iPS-DC的分化進程,使整個培養過程縮短為17天,這種改變相對于文獻方法減少了培養步驟,節約了時間成本和試劑成本,但形成這一現象的機制仍需進一步研究。

iPS細胞向DC的分化誘導是經過iPS細胞向HSC方向分化,再向白細胞方向,最后分化成DC的過程實現的,因此這一過程是動態變化的,本研究在不同的時間節點收集細胞,利用流式抗體染色分析的方法對細胞進行檢測時發現培養過程中各個節點的細胞確實表現出了兼有兩種細胞表面標志物的特點。其中CD309與CD34被認為是HSC的代表性表面標志物[9-10],CD45分子為白細胞的表面標志物[11],本研究中在分化的第2階段第3天,細胞同時兼有CD309、CD34和CD45分子,并開始少量表達代表DC的CD11b和CD11c分子;當分化進行到第3階段的第5天時,代表HSC的CD309和CD34就已經消失或者極少表達,而CD45、CD11b和CD11c分子表達大幅提高;到了第3階段的第7天,DC的表面分子CD11b、CD11c的表達已達80%～90%。在經過LPS的刺激后,iPS-DC細胞上的第一信號分子MHCⅡ與第二信號分子CD40、CD80和CD86的表達均大幅度提高,說明LPS刺激后的iPS-DC變成了成熟狀態的DC。

骨髓細胞培養的BM-DC是一種經典的體外培養DC,本研究將BM-DC當作iPS-DC的參照。本研究發現在細胞表型方面,無論是作為DC表面標志物的CD11b和CD11c的表達,還是作為DC成熟狀態標志的第一、二信號分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達,iPS-DC均與BM-DC的表現一致。在細胞功能方面,iPS-DC在未成熟階段對糖類抗原Dextran與蛋白質抗原OVA表現出很強的吞噬能力,經過LPS刺激后成熟的iPS-mDC對抗原的吞噬能力降低,這種變化符合DC從抗原吞噬階段到抗原遞呈階段功能改變的特點,并且iPS-mDC與BM-mDC在對于抗原吞噬的表現上也相似;作為抗原遞呈細胞,DC最重要的功能是對于初始T細胞的激活能力,本研究利用混合淋巴細胞培養實驗發現iPS-mDC表現出比BM-mDC更強的對于初始T細胞的激活能力,這種激活能力與DC的細胞數量成正比。

綜上所述,本研究中誘導的iPS-DC在細胞表型和功能上均與BM-DC表現相當,證明這是一種可行的體外獲取DC的方法。本研究改良了誘導iPS向DC分化的方法,縮短了培養時間,節省了培養成本,為iPS-DC的應用研究提供了新方法。