miR—101調控非小細胞肺癌的發病機制

王海江　宋麗霞　汪文斐　楊爭　夏照華　黃丕來　李國保　陳培芬　關彩艷

[摘要] 目的 探討miR-101在非小細胞肺癌發生、發展中的作用以及新的分子調控機制。 方法 將miR-101轉染到非小細胞肺癌A549細胞株，比較測量人類非小細胞肺癌組織及癌旁組織的miR-101表達水平。采用生物信息學技術預測miR-101在c-Fos的3′UTR潛在結合靶點，然后采用Western blot法和基因敲除方法檢測c-Fos的表達和功能。 結果 分析miR-101在非小細胞肺癌組織及癌旁組織表達，miR-101在非小細胞肺癌組織中低表達（0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003，P=0.036），過表達miR-101抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖并誘導細胞凋亡。并且在非小細胞肺癌細胞中敲除c-Fos和過表達miR-101有相似的效果。 結論 miR-101通過c-Fos靶點調節非小細胞肺癌細胞的生長，因此調控miR-101和c-Fos可以應用于非小細胞肺癌潛在的分子治療。

[關鍵詞] 微小RNA-101；c-Fos；非小細胞肺癌；發病機制

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）24-0008-04

The pathogenesis of miR-101 in the regulation of non-small cell lung cancer7

WANG Haijiang SONG Lixia WANG Wenfei YANG Zheng XIA Zhaohua HUANG Pilai LI Guobao

CHEN Peifen GUAN Caiyan

Department of Thoracic Surgery， Shenzhen Third People's Hospital， Shenzhen 518112， China

[Abstract] Objective To investigate the role of miR-101 in the development and progression of non-small cell lung cancer and its new molecular regulation mechanism. Methods miR-101 was transfected into non-small cell lung cancer A549 cell line， and the expression level of miR-101 in human non-small cell lung cancer tissues and adjacent tissues was compared. The bioinformatics technique was used to predict the potential binding of miR-101 to the 3'UTR of c-Fos， and then the expression and function of c-Fos were detected by Western blot and gene knockout. Results The expression of miR-101 in non-small cell lung cancer tissues and adjacent tissues was analyzed. miR-101 was down-regulated in non-small cell lung cancer tissues （0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003， P=0.036）. And overexpression of miR-101 was inhibited. Overexpression of miR-101 inhibited proliferation and induced apoptosis in non-small cell lung cancer A549 cells. And knocking out c-Fos and overexpressing miR-101 in non-small cell lung cancer cells had similar effects. Conclusion miR-101 regulates the growth of non-small cell lung cancer cells through c-Fos target， so the regulation of miR-101 and c-Fos can be applied to the potential molecular therapy of non-small cell lung cancer.

[Key words] MicroRNA-101； c-Fos； Non-small cell lung cancer； Pathogenesis

近年來肺癌的發病率及死亡率在全球均位居首位，如果從過去三十年算起，至今中國肺癌的發病率增長了465%。估計2017年中國肺癌發病率可上升至80萬例，而死亡人數達70萬例，肺癌已成為人類癌癥死亡的主要原因之一。此外，隨著人口老齡化和環境污染加劇，肺癌發病率具有逐年上升的趨勢。大部分肺癌是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），占肺癌總發病率的80%左右[1]。不幸的是，大部分的NSCLC患者在診斷時已經是肺癌晚期或遠處轉移[2]，因此，NSCLC的治療效果一直很差，預后也不理想。可見，肺癌日益成為國內外醫學界面臨的一個嚴峻挑戰，對肺癌（特別是NSCLC）發病機制和防治手段的探索非常迫切，因此，進一步研究調控NSCLC發生發展的機制具有重要意義。本研究對11例NSCLC組織及11例癌旁組織進行微小RNA-101（miR-101）表達分析，探討miR-101在NSCLC臨床組織中的表達和功能。

1 材料與方法

1.1組織樣本和細胞系

選取我院自2016年11月～2017年10月胸外科手術切除的11例經病理確診為NSCLC組織標本和與之匹配的癌旁組織，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。本研究通過我院倫理委員會審查并批準，所有實驗均按照相關的指南和規定完成。

NSCLC細胞株A549來源于ATCC（Manassas，VA，USA），從中國科學院生物化學與細胞生物學研究所獲得。用補充10%胎牛血清、2 μM谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養液培養細胞。

1.2 RNA提取和實時定量PCR（RT-PCR）

使用TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）按照產品說明書提取總RNA，并于-80 °C下保存備用。檢測miRNA表達時，使用ABI miRNA反轉錄試劑盒（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）將約10 ng RNA反轉錄為cDNA，并使用U6基因作為內參對照。檢測c-Fos表達時，根據產品說明書使用ABI反轉錄試劑盒（Applied Biosystems，USA），將每個樣品的1 μg總RNA反轉錄為cDNA。使用ABI SYBR Green Master試劑盒（Applied Biosystems， USA），按照說明書，對每個樣品進行qRT-PCR分析，每個樣本一式三份，重復操作3次。以GAPDH作為內參，所用引物序列為：上游：（1）C-Fos：5′-CGTGCCAGACATGGACCTAT-3′（正向）和5′-CGGGGTAGGTGAAGACGAAG-3′（反向）；下游：（2）GAPDH： 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′（正向）和5′-GCATGGACTGTGGTCATGAG-3′（反向）。

根據下列方法計算表達比：

MiR-101表達=2-CT值（miR-101）-CT值（U6）；

c-Fos表達=2-CT值（C-Fos）-CT值（GAPDH）。

1.3 miRNA mimics、c-Fos siRNA 和轉染

設計人miR-101雙鏈模擬物（miR-101）和陰性對照寡核苷酸雙鏈模擬物（miR-NC），并由廣州銳博生物科技有限公司（中國廣州）合成，c-Fos siRNA和對照siRNA寡核苷酸均購自Santa Cruz 公司（Santa Cruz，USA）。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）按照產品說明書進行miRNA或siRNA轉染。

1.4 miRNA靶點預測

利用網站程序www.microRNA.org檢索可能的miRNA靶基因。

1.5 熒光素酶檢測

使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen，USA），按照產品說明書，將c-Fos 3UTR質粒、海腎熒光素酶（Renilla luciferase）pPRL-TK載體（Promega，Madison，WI，USA）和miR-101 mimics/miR-NC mimics轉染到A549細胞中，48 h后測定雙熒光素酶報告基因測試系統（Promega，USA）的發光強度。

1.6 細胞存活率分析

使用細胞計數KIT-8（CCK-8）分析試劑盒（Dojindo，Japan），根據產品說明書測定細胞存活率。

1.7 Caspase 3/7 活性

按照產品說明書（Pierce，USA）進行Caspase 3/7活性分析。將 A549細胞接種至96孔培養板中進行培養，在測試之前，用PBS洗滌細胞，然后將細胞與Caspase Glo 3/7試劑室溫下孵育1～2 h。使用微孔板光譜分析儀（Tecan Infinite M200，Switzerland）測定每個樣品的發光強度。

1.8 免疫印跡（Western blot）分析

提取總蛋白時，用1×PBS洗滌細胞，然后用RIPA緩沖液于冰上裂解細胞15 min，12000轉/min離心15 min，收集上清。按照實驗步驟，用不同抗體對提取的蛋白質進行免疫印跡測試，使用的一抗為抗c-Fos（稀釋：1：2000）和抗GAPDH（1：10000抗體（Cell Signaling Technology，USA）。

1.9 統計學方法

采用SPSS 20.0進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用百分比表示，采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關系數。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA表達分析

本研究對11例非小細胞肺癌組織及11例癌旁組織進行miRNA表達分析，發現miR-101在非小細胞肺癌組織中呈低表達狀態（0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003，P=0.036）。

2.2 miR-101可調控非小細胞肺癌細胞生長

本研究進一步對miR-101生物學功能進行探討。采用miR-101mimics增高非小細胞肺癌A549細胞內miR-101的水平，結果發現：miR-101過表達后，A549細胞的增殖下降[（50±5）% vs（95±4）%，P=0.001]（表1）。此外，檢測細胞內Caspase 3/7水平，結果發現A549細胞內Caspase 3/7水平增高（4000±500 vs 2800±510，P=0.010）（表1），提示A549細胞發生了凋亡。上述的結果表明：miR-101可調控非小細胞肺癌的生長。

2.3 miR-101調控c-Fos的表達

為了進一步探討miR-101的作用機制，本研究對其靶基因進行了分析，發現c-Fos與miR-101存在結合靶點（圖1A）；熒光色素酶實驗顯示：miR-101 mimics可下調含結合位點的熒光質粒的表達（圖1B）；此外，A549細胞轉染了miR-101 mimics后，c-Fos表達下調[（60±5）% vs（98±3）%，P=0.001]（圖1C）。這些結果提示：c-Fos是miR-101的靶基因。

2.4 c-Fos調控非小細胞肺癌細胞生長

為進一步探討c-Fos對非小細胞肺癌的影響，本研究采用c-Fos siRNA轉染非小細胞肺癌A549細胞，發現A549細胞增殖下降[（60±4）% vs （98±3）%，P=0.001]，Caspase 3/7表達增加[（3600±200） vs （2400±300），P=0.001]（表2），其結果與轉染miR-101一致。這提示：c-Fos可調控非小細胞肺癌細胞生長，而c-fos可能是miR-101的功能基因。

2.5 c-Fos在非小細胞肺癌組織中高表達

為進一步探討c-Fos在非小細胞肺癌的表達，本研究對11例非小細胞肺癌組織及11例癌旁組織進行mRNA表達分析，發現c-Fos呈高表達狀態（0.0050±0.0010 vs 0.0015±0.0005，P=0.0086），這與miR-101表達相反。進一步驗證了上述c-Fos可能是miR-101功能基因的研究假設。

3 討論

miRNAs是一類非編碼單鏈微小分子RNA，是機體非常重要的調控分子[3]。miRNAs全長為18～25 bp，由基因組轉錄出具有莖環結構的轉錄前體，再經加工而成。miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對形成引導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而表現在轉錄及轉錄后水平對靶基因的表達進行調控。基因組中，1/3以上的基因受miRNAs調控，一個miRNA可結合多個靶基因，而一個mRNA也可由多個miRNA共同調節，從而形成復雜的網絡調控系統。

許多研究證實miRNAs是多種腫瘤發生過程中關鍵的調控分子[4-7]，在NSCLC中也發生miRNA表達改變。本研究證實了在NSCLC中miR-101和c-Fos的功能和相互作用。miR-101在NSCLC組織中的表達下調，這與以前的研究結果也是一致的[8]。過表達miR-101抑制非小細胞肺癌A549細胞生長，表明miR-101是NSCLC的腫瘤抑制因子[9，10]。這些均支持過度表達miR-101是NSCLC的一種潛在的基因治療，可能會使NSCLC患者治療獲益。

已有研究表明，肺癌組織細胞中，let-7、miR-15、miR-30、miR-126及miR-142等miRNA表達下調；而miR-21、miR-27、miR-93、miR-128、miR-155、miR-181、miR-214以及miR-301等在肺癌細胞中高表達[5，11-13]。而這些miRNA亦調控肺癌細胞增殖等生物學行為。miRNA的調節功能是通過直接作用靶基因與3'UTRs的相互結合而發揮作用。在這項研究中，螢光素酶實驗顯示：過表達miR-101可下調含結合位點的c-Fos熒光質粒的表達，此外，A549細胞轉染了miR-101后，c-Fos表達下調。這些結果證實c-Fos是miR-101的靶基因。

c-Fos是一種重要的核內癌基因，經mRNA轉錄后的c-Fos蛋白，由380個氨基酸組成，其中含有4個外顯子和3個內含子。具有亮氨酸拉鏈結構，內含二聚化結合區可與DNA中的5-TGAG/CTCA-3序列結合而轉錄激活。因此，它調節基因表達并參與多種生物過程。考慮到在腫瘤發生和轉移相關基因的激活中c-Fos的重要性，研究了c-Fos在miR-101介導的抗腫瘤中的作用。敲除c-Fos和miR-101過表達有類似的效果。 因此，這些結果表明miR-101在NSCLC A549細胞上的生物學功能至少部分是通過c-Fos靶基因完成。miR-101和c-Fos相互作用在其他腫瘤如骨肉瘤、膀胱癌、肝細胞癌和子宮內膜癌中也已有報道[5，9，14]。隨后，c-Fos被確定為miR-101在這些腫瘤中的直接靶基因，并且在轉錄后受miR-101負調控，這與目前研究一致。

隨著EGFR突變/ALK融合/ROS1融合等肺癌系列致癌驅動基因的相繼確定，我國及國際上多項研究表明靶向治療藥物大大改善和延長攜帶相應驅動基因的NSCLC患者的預后和生存[15-19]。本研究認為miR-101通過直接抑制c-Fos的蛋白質表達水平，在一定程度上成為NSCLC抑制劑，因此，調控miR-101和c-Fos可以應用于NSCLC潛在的分子治療。

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（收稿日期：2018-05-28）