黑果腺肋花楸組織培養與快速繁殖

張成霞， 吳 紅， 劉 行， 居 濤， 李波廣， 王 瑞， 仲啟明， 湯庚國， 張衡鋒

(1.江蘇農牧科技職業學院園林園藝學院，江蘇泰州 225300； 2.南京林業大學森林資源與環境學院，江蘇南京 210037)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)是引自美國東部的一種薔薇科腺肋花楸屬的落葉灌木，其是集藥用、食用及城市綠化于一體的優良樹種，耐貧瘠、掛果早、經濟效益高，有很大的市場前景[1]。1990年以后陸續被引入我國東北，并定植于遼西地區[2]。由于其樹形優美、觀賞期長，是春觀葉、夏觀花、秋觀果的優質綠化樹種[3]，可孤植也可在公園、路旁等城市綠地中大量種植[4]。黑果腺肋花楸鮮果中黃酮類物質較高，果實富含花青素、多酚、胡蘿卜素等[5]，對心血管疾病具有特殊療效，且具有抗衰老功能，廣泛應用于醫藥和功能食品工業[6]；同時，黑果腺肋花楸抗旱、抗寒能力強，且生長所需水分很少，故在降水較少的干旱地區也完全可以存活，極限低溫-40 ℃以上的氣候也能正常生長發育[3，7]。黑果腺肋花楸根系為淺根性，水平根發達，枝條萌蘗能力強，對30～40 cm 土層的固定力強，病蟲害極少，對風害、冰雹等自然災害抗性強，保持水土效果較好，生態能力強[8]。當前黑果腺肋花楸種苗的市場需求量大，由于傳統播種繁殖和扦插育苗速度緩慢且實施困難，采用組織培養方法加可快其繁殖速度，能在短時間內獲取大量組培苗，滿足市場對其種苗的需求。國內有關黑果腺肋花楸組培快繁的研究報道僅局限于原生質體、胚乳愈傷組織、組培苗瓶外生根、不定芽的誘導與增殖等方面[8-12]，對不同外植體誘導的篩選、增殖、組培苗生根和馴化移栽等研究尚未見報道，故本研究以黑果腺肋花楸為材料，選擇不同種類的外植體進行組織培養快繁體系研究，擬篩選出適宜黑果腺肋花楸快繁的生長調節劑濃度組合，為進行工廠化育苗的快速繁殖提供理論依據，同時為大面積開發黑果腺肋花楸優良種苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料于2015年10月從遼寧引種栽培在江蘇農牧科技職業學院園林園藝學院實訓種植基地。2016年4月，在已經萌芽的黑果腺肋花楸植株上選取生長健壯、無病蟲害的枝條供試驗用。試驗在江蘇農牧科技職業學院園林園藝學院組培室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌材料的獲得與消毒 從黑果腺肋花楸所采的枝條上分別取材腋芽、莖段和葉片，切成小段，放入適量水中，然后用自來水沖洗30 min。將腋芽、葉片、莖段先用75%乙醇漂洗15～30 s，然后用氯化汞溶液對腋芽、葉片、莖段分別消毒30、15、60～120 s，后用無菌水沖4～5次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分供試用。本試驗培養基pH值均調至 5.8～6.0，高壓滅菌(1 100 Pa，121 ℃)15 min。培養室溫度為(23±2) ℃，光照度為1 500～2 000 lx，光照時間為 16 h/d。

1.2.2 外植體的誘導 將已消毒的腋芽、莖段(切除兩端，留長度約為1.5 cm)、葉片(大小切成為0.5～0.8 cm)分別接種到添加不同濃度(1.0、2.0、3.0 mg/L)的6-BA和NAA(0.1、0.2和0.3 mg/L)的MS基本培養基上(表1)，每個處理接種30個外植體，重復3次。每7 d觀察1次，30 d后分別統計腋芽、葉片、莖段的誘導率和生長情況。

誘導率=出愈外植體個數/接種外植體個數×100%[13]。

表1 外植體誘導的因素水平

1.2.3 初代愈傷組織的增殖培養 選擇無污染、長勢好的初代愈傷組織，分別接種到添加不同濃度的6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L)的MS基本培養基中(表2)，每個處理接種30個愈傷組織，重復3次。每4 d觀察1次，30 d后統計結果，計算愈傷組織分化率，并記錄生長狀況。

愈傷組織分化率=形成不定芽的愈傷組織數/總愈傷組織數×100%[13]

表2 增殖培養的因素水平

1.2.4 組培苗的生根誘導 將長度約2 cm的植株轉接至含有不同濃度的NAA(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/L)和IBA(0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mg/L)的1/2 MS培養基上(表3)進行生根培養。30 d后對生根率、根數、根長和苗生長情況分別進行統計。

表3 生根誘導的因素水平

1.2.5 組培苗馴化與移栽 生根培養到19 d時，選取根系健壯的黑果腺肋花楸無菌苗進行馴化和移栽。首先，將無菌苗從培養室移至常溫室內，去掉封口膜放置3 d，然后取出苗用自來水沖洗根部附著的培養基，最后將苗移栽到事先準備好的草炭土和珍珠巖的混合基質(V草炭土∶V珍珠巖=1 ∶1)中，浸透水后放置在通風良好、濕度較高、光照充足的環境條件下培養，觀察記錄幼苗生長情況，30 d后統計移栽成活率。

1.3 數據分析

試驗數據先用Excel進行初步處理后，用DPS(15.10)高級版軟件對數據進行方差分析，試驗數據以“平均數±標準差”表示，P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同濃度生長調節劑組合對不同外植體誘導的影響

從表4可以看出，將黑果腺肋花楸的腋芽、莖段和葉片分別接種到添加不同濃度的6-BA和NAA組合的基本培養基中，4 d腋芽左右開始萌動，莖段和葉片6 d左右開始萌動。腋芽在A6組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)的誘導率最高，達86.67%，顯著高于其他組合處理；其次是A3組合(6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)，誘導率為71.11%，其顯著高于A8(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)、A1(6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L)和A9組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)，且A1和A9組合的誘導率最低，為53.33%。莖段誘導率在A5組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)中誘導率最高，為67.78%，在A6(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)和A9組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)中誘導率最低，為36.67%。葉片的誘導率在A5(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)和A6(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)組合中較高，達60.00%以上，顯著高于A1、A3、A4和A9組合的誘導率，最高幅達66.65%。

在同一生長調節劑組合下，腋芽、葉片和莖段的誘導率基本表現為腋芽最高，其次是葉片，莖段的誘導率最低(表4)。除A1、A2和A5組合外，其他組合均表現出腋芽的誘導率顯著高于葉片或莖段，增幅范圍在11.62%～136.35%之間。

綜上所述，A5(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)和A6組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)最適于外植體不定芽的誘導；腋芽、葉片和莖段作為外植體誘導時，腋芽的誘導率最高達86.67%，是最理想的材料。

2.2 不同濃度生長調節劑組合對愈傷組織分化培養的影響

將獲得長勢好的初代愈傷組織分別接種到添加不同濃度的6-BA和NAA組合的MS基本培養基中觀察其增殖生長情況，結果表明，不同濃度的生長調節劑組合對初代愈傷組織增殖分化有一定的促進作用。在B7(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)、B5(6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)和B8組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)培養基上接種后，4 d就可看到伸長，并長出小的葉片，10 d后莖段已長到1.0 cm，基部產生綠色或淡綠色愈傷組織，并出現許多芽苞，20 d后分化大量小芽，芽深綠色(圖1)；而B14(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L)和B15組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)在接種后7 d才看到伸長，15 d后基部產生淡綠色的愈傷組織，分化極少小芽，芽淺綠色，少量的根。本試驗結果說明愈傷組織的分化主要受細胞分裂素6-BA與生長素NAA二者相對濃度的影響，6-BA和NAA相對濃度增大時均有利于愈傷組織的分化和增殖。

表4 不同濃度生長調節劑組合對不同外植體誘導的影響

注：表中數據是3個重復的平均值，同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同行中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

黑果腺肋花楸的初代愈傷組織分化率存在顯著差異，由表5可看出，B7(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)的愈傷組織分化率最高，達83.33%，其次是B5(6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)、B8(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)和B6

組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)，分化率分別為85.56%、83.33%和78.89%，分化率最低的是B15組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)，為40.00%。除B5和B8組合外，B7組合的愈傷組織分化率顯著高于其他各處理組合，最高幅達116.68%。

綜上所述，B7(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)、B5(6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)和B8(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)組合較適宜黑果腺肋花楸愈傷組織增殖分化，其生長狀況也較好。

表5 不同濃度生長調節劑組合對愈傷組織增殖分化的影響

注：表中數據是3個重復的平均值，同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.3 不同生長調節劑濃度對組培苗生根誘導的影響

將經分化培養長到2 cm左右的黑果腺肋花楸組培苗轉接至1/2 MS培養基上，并添加入不同濃度的NAA和IBA進行生根誘導，試驗過程中發現黑果腺肋花楸無菌苗較易生根，接種后4 d左右開始小苗基部出現根原基突起，逐漸長出白色新根，30 d后統計結果(表6)大部分苗生根。生根率在C4培養基(1/2MS+NAA 0.7 mg/L)中最高，達95.33%，顯著高于其他處理，生根率大于80.00%的從高到低排序為C8>C3>C7>C2=C9，其對應數值分別為91.67%、88.00%、83.00%、82.33%、82.33%，而C10培養基(1/2MS+IBA 0.9 mg/L)的生根率最低，為69.00%，除C2、C7和C9間差異不顯著外，其他各處理間差異顯著。根數在C4、C8培養基中較多，平均為5.67、5.37條，顯著高于其他各處理培養基，最高幅達220.34%；C3培養基中的根數次之，為4.57條，與其他處理間差異顯著；C10培養基中的根數最少，為1.77條。根長變化表現出與根數一樣的趨勢，在C4、C8培養基中較長，為3.32、3.13 cm，顯著高于其他各處理培養基，其次是C7>C9>C3；最短根長在C10培養基中，僅為1.17 cm，顯著低于其他9個處理。組培苗在不同培養基上的生長狀況與生根率、根數和根長表現一樣，即C4和C8培養基中生長較佳，在C10培養基中生長一般。

由試驗結果可知，C4(1/2MS+NAA 0.7 mg/L)、C8(1/2MS+IBA 0.5 mg/L)和C3(1/2MS+NAA 0.5 mg/L)組合的培養基較適宜黑材料果腺肋花楸組培苗的生根誘導和生長(圖2)。

2.4 組培苗的馴化與移栽

將黑果腺肋花楸生根苗移栽到草炭土 ∶珍珠巖為1 ∶1的基質中，30 d后統計移栽成活率，試驗結果表明，移栽成活率高達94.78%，且苗的長勢較好(圖3)。

3 討論與結論

植物組培快繁是當前大面積種苗繁育的主要方法之一，其具有節藥材料、縮短苗木生產時間等優點。通過組培快繁可提高黑果腺肋花楸種苗的繁殖系數，彌補種子繁殖、扦插等傳統育苗方法的不足。已有研究報道證明，黑果腺肋花楸的離體培養、植株再生是切實可行的[7]。目前已發現有利用原生質體、胚乳、組培苗瓶外生根以及不定芽誘導與增殖的研究報道[8-10，12]。本試驗選用黑果腺肋花楸的不同外植體為材料，進行誘導篩選、增殖、生根、組培苗馴化移栽等一系列再生體系研究，在此過程中發現不同濃度生長調節劑組合在組織培養過程中起重要作用，可見培養基中添加外源激素直接影響體細胞愈傷組織的誘導及分化[14]。

表6 不同生長調節劑對組培苗生根及生長狀況的影響

注：*的數目表示組培苗生長情況：*表示生長一般，**表示生長良好，***表示生長很好，****表示生長最佳。

本研究選取黑果腺肋花楸的腋芽、莖段和葉片不同外植體用不同濃度組合的生長調節劑進行誘導，發現MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養基組合最適于莖段和葉片的誘導，而MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養基最適于腋芽的誘導，這與李冬杰等研究報道結果[11]相似。3種外植體中以腋芽的誘導率最高，其次是葉片，莖段的誘導率最低，說明本試驗中腋芽是最理想的外植體誘導材料。選配適宜的外植體是植物組培快繁的第1步，因為不同外植體所處的生理狀態、分化程度不同，加之外源激素的加入從而表現出不同的再生能力。本試驗中低濃度和高濃度的6-BA和NAA均不利于腋芽、莖段和葉片外植體的誘導，可能是過低濃度的生長調節劑組合沒有達到外植體誘導的劑量，而高濃度的生長調節劑組合抑制了黑果腺肋花楸外植體的誘導。

試管苗能否不斷增殖并進行繼代培養，是植物組織培養能否成功的關鍵。植物生長調節劑是組織培養中必不可少的物質，不同激素組合對于腋芽增殖的效果各不相同[15-16]。本試驗對獲得的黑果腺肋花楸初代愈傷組織的增殖分化試驗中，最適合組織分化的培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，分化率達86.67%，且分化大量小芽，芽深綠色，粗壯。說明較高濃度(1.0～2.0 mg/L)6-BA與較低濃度(0.4～1.0 mg/L)的NAA組合使用時效果最佳，這與趙健竹等對黑果腺肋花楸不定芽誘導與增殖的研究結果[8]、張春雨等對黑果腺肋花楸離體葉片愈傷組織誘導及再分化的研究結果[17]一致。

生根培養是植物組培快繁的第3個階段，關系到組培苗能否健壯生長及后期移栽的成活率。本試驗用不同濃度的IBA和NAA對黑果腺肋花楸組培苗的生根率、根數、根長及生長狀況等指標進行測定觀察，IBA的濃度在0.3～0.5 mg/L、NAA的濃度在0.5～0.7 mg/L時生根率、根數、根長結果表現最優，組培苗長勢最佳，這與李冬杰等的研究結果[11]一致。將生長健壯的組培苗練苗后移栽到草炭土和珍珠巖配比為1 ∶1的基質中，成活率高達94.78%，與高方可等的研究結果[12，18]一致。

本試驗以黑果腺肋花楸的腋芽、莖段和葉片為外植體進行誘導，然后對獲得的初代愈傷組織進行增殖培養、組培苗進行生根誘導及馴化移栽，成功建立黑果腺肋花楸組織培養快繁再生體系，為其種苗大面積組培快繁、栽培及工廠化育苗提供了一定的理論基礎與科學依據，同時為黑果腺肋花楸的可持續發展利用奠定了基礎。