湖北麥冬葉片碳代謝對土壤干旱的響應

孫永林， 湯尚文， 徐 馨， 柯亞婕， 王啟會

(湖北文理學院化學工程與食品科學學院，湖北襄陽 441053)

在全球氣候變暖的背景下，干旱已成為限制作物生長和產量最重要的生態因子。據全球氣候評估權威組織-機構——政府間氣候變化委員會(IPCC)報道，到21世紀末，地球表面溫度將會升高1.1～6.4 ℃[1]。隨著氣候變暖的發展，水分蒸發量將會進一步加大，水分虧缺將會加劇，干旱發生的頻率和強度也會增加，持續的時間也會更長[2]。干旱主要通過降低植物的吸水能力從而影響植物的生長，而低水分供應下植物生長受限主要是因為碳代謝受阻。碳代謝是植物生命活動的中心，植物要想長期存活需要同化足夠多的碳來構建生物量。植物體內的碳可分為兩大類，一類是以纖維素、木質素等為代表的用來進行形態建成的結構性碳，另一類是以可溶性糖和淀粉為代表的非結構性碳，非結構性碳可在植物遭受環境脅迫時起階段性緩沖作用[3]。以往研究表明，在輕度和中度水分虧缺下，碳代謝主要受氣孔關閉的限制，氣孔關閉降低了胞間二氧化碳的濃度，導致二氧化碳擴散到羧化位點的速率降低。隨著干旱程度的進一步加劇或干旱持續時間的延長，光合酶活力降低、細胞結構破壞等代謝損傷就會發生，在這種情況下，非結構性碳將會更多地分配給可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿等富含碳元素的滲透調節物質，從而調節細胞的滲透壓[4-8]。

湖北麥冬[LiriopeSpicata(Thunb.) Lour. var.proliferaY. T. Ma]是百合科山麥冬屬藥食兩用植物，塊根質地柔韌，味甘，含有多糖、皂苷、黃酮等人體所需的營養成分，具有滋陰生津、潤肺止咳等功效，是襄陽大宗道地藥材，產量高于川、杭麥冬[9]。襄陽地處鄂西北，是湖北季節性干旱易發地區，從2010—2016年，旱情逐漸加重，重旱、特重旱頻發，且大旱年出現的頻率呈增加趨勢，農作物欠收甚至絕收，對農業生產造成嚴重的影響。對湖北麥冬這種中藥材而言，前人對其生藥學特性進行了大量研究[10-13]，但對在持續干旱條件下碳代謝的研究尚未涉及。本試驗采用生物化學的方法，對生長在持續干旱條件下的盆栽湖北麥冬葉片中與碳代謝相關的光合色素及關鍵酶活力進行了分析，同時測定了非結構性碳(可溶性糖、淀粉和脯氨酸)的含量，從而揭示持續干旱條件下湖北麥冬的抗旱機制，為其規模化種植提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

盆栽試驗在湖北文理學院鄂西北植物研究所內進行。2015年3月初，從襄陽市歐廟鎮麥冬種植基地選取長勢基本一致、生長狀況良好的一年生麥冬苗，單株移栽于規格相同的塑料桶(口徑27.5 cm、底徑22 cm、高31 cm，容積約為19 L)內，桶內裝當地黃棕壤土8 kg，土壤田間持水量為36.60%。先正常供水4周以保證移栽后的麥冬苗正常生長，4月1日停止澆水，對照組正常供水，每隔10 d收樣1次，共收樣3次(0、10、20 d)。每次收樣各處理各收5個重復，樣品置于 -80 ℃ 超低溫冰箱用于生理指標的測定。試驗期間，晴天露天培養，陰雨天則置于遮雨棚內。

1.2 測定指標

1.2.1 葉相對含水量 參照Galle等的方法[14]測定麥冬葉相對水分含量(relative water content，RWC)。選擇長勢良好、大小基本一致的5株麥冬，取發育完全的葉片5片，分別稱其鮮質量(FW)，然后將葉浸沒于蒸餾水中，置于4 ℃下至飽和狀態后取出，擦干表面水分測其飽和鮮質量(TW)，再將葉片在鼓風干燥箱內80 ℃下烘干至恒質量(DW)。按照下列公式計算出RWC：

RW=(FW-DW)/(TW-DW)×100%。

1.2.2 光合色素的含量 光合色素的提取采用高俊鳳的方法[15]。準確稱取30 mg葉片，研磨成勻漿后，加入80%的丙酮1.9 mL，暗中提取24 h，室溫條件下離心10 min(15 000 r/min)。取上清液0.5 mL，加入80%丙酮2 mL，在波長為663、645、470 nm處測吸光度，測得葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量，葉綠素a與葉綠素b之和即為葉綠素總量，同時測得葉綠素a和葉綠素b的比值。空白對照為80%的丙酮。

1.2.3 核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)活力測定 核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶活力測定參照Dewir等的方法[16]略有改動。稱取鮮葉300 mg在液氮中研磨成粉末狀，加入1 mL預冷的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值 7.5，內含16 mg PVP、1 mmol/L二硫蘇糖醇、0.2 mmol/L EDTA·Na2、5 mmol/L巰基乙醇、10 μL Triton、2 mmol/L MgCl·6H2O和5 mmol/L NaHCO3)，4 ℃下離心20 min(15 000 r/min)，上清液即為粗酶液。反應體系包括 100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)、20 mmol/L NaHCO3、5 mmol/L MgCl·6H2O、3.5 mmol/L ATP、3.5 mmol/L 磷酸肌酸、0.4 mmol/L NADH、0.24 U/μL磷酸肌酸激酶、0.24 U/μL 3-磷酸甘油醛脫氫酶、0.24 U/μL 3-磷酸甘油酸激酶、0.5 mmol/L RUBP，用100 μL粗酶液啟動反應，28 ℃下測定在340 nm波長下吸光度的變化，共測3 min，以1 min酶活力變化0.01為1個酶活單位(U)。

1.2.4 可溶性糖含量 可溶性糖含量的測定采用蒽酮-H2SO4比色法[17]。

1.2.5 淀粉含量 淀粉含量的測定采用高俊鳳的方法[15]。準確稱取葉片30 mg，用80%乙醇溶液1.5 mL在80 ℃水浴條件下提取30 min，冷卻至室溫后，4 ℃下離心20 min(15 000 r/min)，棄去上清液，往沉淀中再加入80%乙醇溶液1.5 mL，按照同樣的方法再提取2次，留沉淀。往沉淀中加入蒸餾水0.4 mL，沸水浴1 h，冷卻至室溫后，往其中加入9.2 mol/L HClO4，攪拌15 min，再加蒸餾水0.8 mL，混勻后，15 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL，加蒽酮-H2SO4溶液2 mL，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，在620 nm處測定吸光度。

1.2.6 脯氨酸含量 脯氨酸含量的測定采用磺基水楊酸法[15]。

1.3 數據處理

所得數據采用Excel軟件計算平均值和標準差，用SPSS 17.0分析不同水分處理之間的差異顯著性(P<0.05)，并用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 干旱對湖北麥冬葉片相對水分含量的影響

RWC是表征植物組織水分狀況的重要指標。由圖1可知，在正常水分條件下，隨著時間的延長，葉片RWC無顯著性變化。但在干旱條件下，隨干旱持續時間的延長，葉片RWC顯著降低(P<0.05)，與對照相比，當干旱持續10 d時，RWC含量降低了6.4%，而當干旱持續20 d時，RWC含量降低了14%，表明土壤中的水分狀況直接影響植物葉肉組織內的水分分布，可能因為土壤干旱發生后，植物根系的吸水能力減弱，通過質外體和共質體途徑運輸到葉片中的水分也會相應減少，干旱持續時間越長，這種影響越顯著。

2.2 干旱對湖北麥冬葉片光合色素的影響

光合色素是植物吸收光能進行光合作用的重要物質，主要包括葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素，主要參與光能的吸收、傳遞并引起原初光化學反應。由表1可知，在正常水分條件下，3類色素的含量均有增加，但并不顯著。在干旱10 d時，與對照相比，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均顯著降低(P<0.05)，在持續干旱20 d時，降幅更大。但持續干旱10 d和20 d時，葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量無顯著差異。另外，葉綠素a含量與葉綠素b含量比值(葉綠素a/b)為3左右。表明持續干旱對光合色素的含量有顯著影響，但相比之下對葉綠素a的影響較為顯著。

表1 干旱對湖北麥冬光合色素的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 干旱對湖北麥冬葉片核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶活力的影響

核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是光合碳同化過程中卡爾文循環里催化羧化反應的關鍵酶，進入葉綠體的CO2與其受體核酮糖-1，5-二磷酸在Rubisco的催化下生成3-磷酸甘油酸，CO2得以固定，從而實現了無機物向有機物的轉化[18]。由圖2可知，在正常水分供應的條件下，隨發育時間的延長，Rubisco活力顯著增強并趨于穩定。當土壤干旱持續10 d時，受旱植株的Rubisco活力與對照相比無顯著性變化，但隨著干旱時間的進一步延長，當持續干旱20 d時，受旱植株的Rubisco活力顯著降低(P<0.05)。表明一定程度的土壤干旱對植物的羧化反應并無顯著性影響，而持續干旱則嚴重降低Rubisco催化能力，從而影響著植物的光合碳固定。

2.4 干旱對湖北麥冬葉片可溶性糖含量的影響

土壤干旱可導致植物遭受滲透脅迫，在一定的脅迫范圍內，植物可通過在細胞內累積無機離子或有機溶質進行滲透調節以維持細胞的膨壓。可溶性糖是重要的有機滲透調節物質，對細胞壓力勢的維持起重要調節作用[19]。由圖3可知，在正常水分條件下，湖北麥冬葉片內可溶性糖含量無顯著性變化。當遭受10 d的干旱脅迫時，與對照相比，受旱植株葉片內可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)，而當干旱持續到 20 d 時，可溶性糖含量則顯著降低(P<0.05)。表明在干旱條件下，湖北麥冬可通過在葉肉細胞內累積可溶性糖以調節滲透勢，從而抵抗干旱脅迫。而當持續干旱進行到一定程度后，植物的滲透調節能力受限，從而表現為參與滲透調節的物質含量顯著降低。

2.5 干旱對湖北麥冬葉片淀粉含量的影響

可溶性糖和淀粉是植物在葉綠體中經光合碳同化合成的2種重要的非結構性碳水化合物，在一定條件下，植物體可發生同化物的再分配和再利用。在逆境條件下，淀粉可通過水解作用轉化為蔗糖、葡萄糖等可溶性糖進行滲透調節[3]。由圖 4可知，在正常供水條件下，淀粉含量無顯著性變化，隨著發育時間的延長，則呈顯著增加趨勢。持續干旱對淀粉含量的影響較為明顯，當干旱持續10 d時，與對照相比，淀粉含量顯著降低(P<0.05)，當干旱持續20 d時，淀粉含量則進一步降低。表明干旱可引起非結構性碳水化合物的再分配，干旱條件下分配給用于淀粉合成的碳減少，而分配給可溶性糖的碳增多，從而緩沖了干旱脅迫對湖北麥冬葉片造成的傷害。

2.6 干旱對湖北麥冬葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物蛋白質的重要組分，在正常狀態下，脯氨酸的含量很低，但在逆境條件下游離脯氨酸會大量累積[18]。由圖 5可知，在正常水分條件下，葉片內脯氨酸含量隨發育進程的延續無顯著性波動。但當干旱進行10 d時，與對照相比，脯氨酸含量顯著增加(P<0.05)，而當干旱持續20 d時，脯氨酸含量顯著增加(P<0.05)，但增幅減小。表明在干旱條件下，植物在細胞內累積較多的脯氨酸以增強滲透調節能力，但干旱持續到一定程度時植物體內脯氨酸的累積量減少，滲透調節能力減弱。脯氨酸累積還可能降低干旱期間蛋白質大量水解產生的游離氨對植物的毒害，貯存氮源和碳源，為逆境解除后恢復生長提供能源。

3 討論與結論

代謝是植物最基本的生命活動過程，碳代謝在植株體內的動態變化直接影響著光合產物的形成、轉化以及產量的形成[20]。光合作用是植物最基本的生理過程之一，也是碳代謝的一個重要組成部分[21]。葉片中葉綠素含量和Rubisco 活性直接影響植物的光合固碳能力。植物通過根系從土壤中吸收水分，利用光能將水和二氧化碳同化形成碳水化合物，而水分不僅是碳代謝的原料，而且也是酶發揮催化效能的媒介物質，因此，土壤水分的供應狀態直接影響植物的光合碳代謝能力。在本研究中，隨著干旱持續時間的延長，葉片中RWC含量顯著降低，葉綠素的合成速度減慢，從而導致光合色素含量的降低，再加上Rubisco活力顯著降低，因此嚴重影響湖北麥冬的光合碳固定能力。以往研究表明，輕度干旱對水稻Rubisco活力無顯著性影響，重度干旱則抑制Rubisco活力從而導致光合速率下降[22]。Majumdar 等以大豆為試驗材料研究干旱脅迫對Rubisco活力的影響，發現Rubisco活力在短期干旱脅迫的早期急劇下降，暗示Rubisco活力對水分脅迫比較敏感[23]。本研究也得出類似的結果，表明土壤干旱通過影響碳代謝過程中的光合色素及光合酶活力等因素，進而影響著植物對二氧化碳的羧化和固定能力，而且干旱程度越深，影響越顯著。

非結構性碳水化合物(主要包括可溶性糖和淀粉)是植物碳代謝的重要產物，其含量變化不僅能反映植物體內的生理狀況，而且還能在植物遭受環境脅迫時起一定的緩沖作用[3]。當植物處在逆境條件下通過光合碳固定制造的有機碳水化合物的量不能滿足代謝的需求時，只能對有限的碳水化合物進行重新分配和利用以提高其利用效率，從而保證在逆境條件下的生長發育[19]。而重新分配和利用的途徑之一便是合成較多的如可溶性糖、脯氨酸等富碳化合物，從而增加細胞內溶質的濃度以調節滲透壓[18]。在本研究中，在干旱脅迫下，湖北麥冬葉片內非結構性碳之間相互轉化，在干旱持續10 d時，淀粉含量顯著降低，而可溶性糖含量顯著升高，暗示湖北麥冬在光合酶活力降低的情況下對葉片內的碳水化合物進行了重新分配。而可溶性糖含量的升高可增強細胞的滲透調節能力，除此以外，富碳分子脯氨酸的含量也顯著升高，滲透調節能力進一步增強。但干旱持續到一定時間后，湖北麥冬葉片內非結構性碳及脯氨酸含量均顯著降低，表明滲透調節能力具有一定的局限性，與干旱脅迫持續的時間及脅迫強度密切相關。

因此，干旱對湖北麥冬葉片內的碳代謝有著顯著的影響，在干旱持續10 d時，光合色素含量、Rubisco活力降低，暗示光合碳固定能力降低。在此情況下，湖北麥冬對葉片內有限的碳水化合物進行了重新分配和利用，將有限的碳更多地分配給可溶性糖和脯氨酸等富碳分子，以提高細胞的滲透調節能力，從而抵御干旱脅迫。但隨著干旱時間的進一步延長，碳代謝及滲透調節能力均降低。