SPME-GC-MS法測定龍膽草中15種有機磷農藥殘留

馮永剛

(牡丹江師范學院，黑龍江牡丹江 157011)

龍膽草(GentianascabraBye)又稱龍膽，為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，主要產于東北三省。據《神農本草經》記載，龍膽“主骨間寒熱，驚癇邪氣，續絕傷，定五臟，殺盅毒”[1]。2010版《中環人民共和國藥典》記載，龍膽草具有清熱燥濕、瀉肝膽火，用于“濕熱黃疸，陰腫陰癢，帶下，濕疹瘙癢，肝火目赤，耳鳴耳聾，脅痛口苦，強中，驚風抽搐”等病癥[2-3]，是一種可人工栽培的中藥材。目前對龍膽草的研究主要集中在品種選育、組織培養、人工種植及其藥用開發方面[1-2]，對其農藥殘留檢測的研究報道較少，但龍膽草種植過程中常使用有機磷農藥來防止各種病蟲害[4-5]，因此研究龍膽草中有機磷農藥殘留檢測方法對于保障龍膽草質量安全尤為重要。目前對有機磷農藥殘留的檢測方法主要有液相色譜[6]、氣相色譜[7]、氣相色譜質譜法[8-9]等。

固相微萃取技術(SPME)是一種集釆樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術，與固相萃取技術相比，固相微萃取操作更簡單方便，費用低，且克服了固相萃取回收率低的缺點[10-13]。本研究采用固相微萃取技術對龍膽草進行樣品前處理，建立了固相微萃取-氣相色譜-質譜儀(SPME-GC-MS)測定龍膽草中15種有機磷農藥含量的檢測方法，該方法具有樣品前處理方便、準確度高、精密度好等特點，可為龍膽草中有機磷農藥的快速測定提供檢測技術。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6890 GC/5973i MS型氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司；SPME萃取頭[50/30 μm DVB(聚二乙烯基苯)/CAR(碳分子篩)/PDMS(聚二甲基硅氧烷)、65 μm DVB/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS]，美國Supelco公司；AD300S-H型均質攪拌機上海重逢科學儀器有限公司；ME204型電子天平，梅特勒托利多。

15種有機磷農藥：甲胺磷、滅線磷、治螟磷、甲拌磷、二嗪磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、對硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、三唑磷，濃度均為 100 mg/L，購自原農業部環境保護科研監測所。乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚均為色譜純，購自德國Merck公司；龍膽草購于黑龍江省牡丹江市康寧堂大藥店。

1.2 GC-MS條件

色譜條件：DB-5MS型毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；不分流進樣方式；進樣口溫度為250 ℃；采用程序升溫方式，初始溫度為50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升溫到200 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速率升溫到250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣(純度為99.99%)，流速為 1.0 mL/min。

質譜條件：電子轟擊電離(EI)離子源；接口溫度為 250 ℃；EI離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；掃描質量范圍m/z為50～350。采用選擇離子掃描模式，15種有機磷農藥的其他質譜參數見表1。

1.3 試驗方法

用均質機將龍膽草粉碎，過200目篩，精確稱取2 g(精度為0.1 mg)樣品于萃取瓶，加入10 mL乙酸乙酯和5 g無水MgSO4，放入轉子后蓋緊瓶蓋，將固相微萃取器的萃取頭插入萃取瓶中，推出纖維頭，切勿接觸溶液及瓶壁。將其置于磁力攪拌器中，恒溫攪拌，吸附后縮回纖維頭，再從萃取瓶中拔出萃取頭，將萃取頭插入GC-MS進樣口，推出纖維頭，在進樣口解析5 min，同時開啟儀器并采集數據。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

采用Scan掃描方式對15種農藥進行全掃描，確定保留時間及母離子；通過碰撞的方式進行二級質譜分析，并優化碰撞電能量，選擇靈敏度高的特征離子對作為定量、定性離子，以所選母離子及其子離子進行選擇離子監測(SIM)掃描，優化后參數見表1，15種農藥總離子色譜掃描結果見圖1。

注：“*”表示定量離子。

2.2 提取溶劑的選擇

考察乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚等不同溶劑對龍膽草中15種農藥的提取效果。由圖2可知，15種有機磷農藥在乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚等溶劑中溶解度不同，但其中乙酸乙酯具有較好的提取效果，15種有機磷農藥提取率在87.3%～103.4% 之間，平均提取率為91.3%。因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.3 SPME萃取頭的選擇

考察了不同SPME萃取頭對龍膽草中15種有機磷農藥平均萃取率的影響(圖3)。PDMS類萃取頭對15種有機磷農藥萃取效果較好，尤其是使用65 μm PDMS/DVB萃取頭時，萃取效果最佳，這可能是由于在PDMS材料上增加高分子材料DVB，可以增加表面積，還可以增強對極性化合物的萃取能力，從而提高萃取效率。因此選擇65 μm PDMS/DVB作為SPME萃取頭。

2.4 SPME萃取條件的優化

以65 μm PDMS/DVB作為萃取頭，選取萃取溫度(A)、萃取時間(B)、攪拌速度(C)3個因素，選用3個水平，設計不同因素水平組合(表2)，采用L9(33)正交設計(表3)，進行SPME萃取條件優化。

通過正交試驗分析(表3)表明，影響SPME萃取效率的因素主次排序為B>A>C，SPME萃取最優的結果為A2B1C2，即在60 ℃下萃取60 min，轉速為600 r/min。通過方差分析可以看出，萃取溫度、萃取時間、攪拌速度對正交試驗無顯著影響(表4)。

2.5 方法線性范圍與檢出限

用正己烷配制5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0 ng/mL 系列15種有機磷農藥混合標準溶液，按“1.2”節GC-MS條件進行測定，以目標物的峰面積(y)和質量濃度(x)建立線性回歸方程(表5)。在5.0～500.0 ng/mL濃度范圍內，15種有機磷農藥具有良好的線性關系，r2≥0.999 1。

根據國際純粹和應用化學聯合會(IUPAC)的規定，對空白溶液測定20次，計算標準偏差，按3倍標準偏差計算方法檢出限，表5結果顯示：龍膽草中15種有機磷農藥的檢出限在5.0～50.0 μg/kg之間。

2.6 回收率與精密度

在空白龍膽草中分別添加50.0、250.0、500.0 μg/mg 3種濃度的15種有機磷農藥混合標準溶液，按“1.2”節GC-MS條件和“1.3”節試驗方法進行測定。15種有機磷農藥的平均回收率為84.1%～105.8%，相對標準偏差(RSD)在1.3%～5.7%之間(表6)。

表2 正交試驗的因素水平

表3 正交試驗L9(33)分析

表4 方差分析結果

表5 線性方程和檢出限

表6 有機磷農藥平均回收率和RSD值(n=6)

續表6

名稱50.0 μg/mg250.0 μg/mg500.0 μg/mg回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)對硫磷94.62.697.62.498.41.6甲基異柳磷96.13.198.42.9100.65.7丙溴磷93.75.696.43.192.61.6三唑磷90.22.493.21.886.61.7

2.7 實際樣品檢測

從黑龍江省牡丹江市大藥店中隨機購買10份龍膽草人參樣品，按照“1.2”節GC-MS條件和“1.3”節試驗方法所建立的SPME-GC-MS法測定15種有機磷農藥殘留量。結果顯示，10份龍膽草樣品中，檢出部分農藥殘留，其中檢出率較高的農藥依次為對硫磷(489.7 μg/kg)、三唑磷(321.6 μg/kg)、甲胺磷(241.5 μg/kg)、甲基對硫磷(157.4 μg/kg)，這說明龍膽草中存在一定的農藥殘留風險，應加強其質量監管。

3 結論

本研究建立了SPME-GC-MS對龍膽草中15種有機磷農藥殘留量的檢測方法。在5.0～500.0 ng/mL濃度范圍內，15種有機磷農藥具有良好的線性關系，r2≥0.999 1；檢出限在5.0～50.0 μg/kg 之間；回收率在84.1%～105.8%，相對標準偏差(RSD)在 1.3%～5.7%之間。該方法具有樣品前處理方便、準確度高、精密度好等特點，可為龍膽草中有機磷農藥快速測定提供檢測技術。