無梗五加果黃酮的提取及其提取物的自由基清除活性比較

馮 穎， 赫子涵

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽 110866)

無梗五加(AcanthopanaxsessiliflorusSeem)別稱短梗五加，衛生部于2008年第12號公告批準其為新資源食品，是一種藥食同源的食品[1]。研究表明，無梗五加的果實具有降血脂[2]、抗腫瘤[3]、抗血小板[4-5]、清除自由基、耐缺氧、抗疲勞等作用[6-8]。近些年來，國內外不斷有將無梗五加果制成果汁、果酒、果干等的報道[9]，其作為新型營養健康食品也受到越來越多的關注。已有研究表明，無梗五加果的主要活性成分包括黃酮、皂苷、香豆素、三萜、酚酸、多糖等[6，10-11]，其中黃酮類化合物是研究的熱點。安琪研究了無梗五加果中總黃酮含量的測定方法[10]。李春芳等建立了無梗五加果提取物中總黃酮含量及金絲桃苷含量的測定方法[12]。李林在對無梗五加果實化學成分的研究中，以金絲桃苷及東莨菪內酯為指標，建立了無梗五加果的質量控制方法[13]。筆者所在課題組通過前期試驗，建立了無梗五加果中黃酮類化合物含量的測定方法、乙醇回流提取及大孔樹脂純化工藝參數，并通過烘箱高溫誘導法、化學發光法及濾紙片法測定表明，無梗五加果黃酮類化合物具有抗油脂氧化、清除羥自由基和超氧自由基的能力，并具有一定的抑菌活性[8，14]。本研究在前期試驗的基礎上，進一步采用超聲波法提取無梗五加果黃酮類化合物，用響應面法優化其提取工藝參數，以提高其提取效率和提取量，并對提取物的各種自由基的清除活性進行測定和比較，旨在促進無梗五加果黃酮類化合物在食品及保健品領域的應用步伐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

無梗五加干果，購自遼寧省丹東農業科學院。蕓香苷標準品、金絲桃苷標準品、槲皮素標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，均購自北京鼎國生物技術有限責任公司；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫等均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

高速中藥粉碎機，浙江省溫嶺市創力藥材器械廠；電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；KQ-250A型超聲反應器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；高效液相色譜，日本島津公司；微量移液器，上海求精生化試劑儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發儀，上海博通經貿有限公司；SHZ-ⅢB型循環水真空泵，上?；茖W儀器有限公司；LG0.2型真空冷凍干燥機，新陽速凍設備制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 無梗五加果黃酮類化合物的提取工藝

1.2.1.1 單因素試驗 將無梗五加果干燥果實粉碎，過40目篩，準確稱取1 g無梗五加果粉末，置于100 mL三角瓶中，加入不同體積、一定體積分數的乙醇溶液，用玻璃紙密封好后置于超聲波反應器中，在超聲功率250 W、室溫(設定為 25 ℃)下超聲提取一定時間。待超聲處理完畢后，真空過濾取濾液，用相應提取溶劑定容至100 mL。取適量體積的溶液，測定其中黃酮類化合物含量。

1.2.1.2 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度、超聲提取時間、提取劑用量為自變量，采用Design Expert 8.0軟件中的中心組合(Box-Behnken)試驗設計原理進行3因素3水平的響應面試驗設計(表1)。采用Design Expert 8.0軟件中的響應優化器進行優化分析，得到回歸模型和優化的工藝參數。

1.2.2 黃酮類化合物含量的測定方法[14]用移液管吸取1.0 mL 樣品溶液于10 mL試管中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，混勻后，靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后放置6 min。加入4.0 mL質量分數為4%的NaOH溶液，用濃度為30%的乙醇定容，搖勻，放置10 min。用紫外-可見分光光度計在500 nm處測定吸光度。同時以不加樣品液的試劑作為空白參比液。將吸光度值代入以蕓香苷為標準品制作的回歸方程中，計算黃酮的含量。

表1 試驗因素水平及編碼值

1.2.3 高效液相色譜分析條件 標準品溶液的配制：用甲醇水溶液(甲醇、水的體積比為1 ∶1)溶解配制成金絲桃苷、蕓香苷、槲皮素濃度分別為0.046、0.057、0.051 mg/mL的混合標準品溶液。

樣品溶液的配制：將超聲提取得到的無梗五加果黃酮提取液經旋轉蒸發儀真空濃縮后凍干，用甲醇水溶液(甲醇、水的體積比為 1 ∶1)配制成濃度為1.3 mg/mL的樣品溶液，混合均勻即得待測樣品溶液。

將上述標準品溶液與樣品溶液分別過0.4 μm濾膜，進樣后依據保留時間定性，確定無梗五加果黃酮類化合物組成。高效液相色譜條件：色譜柱為Agilent TC-C18，柱溫為25 ℃，檢測波長為360 nm，進樣量為10 μL。梯度程序設定見表2。

表2 液相梯度條件

1.2.4 自由基清除活性的測定 將超聲提取得到的無梗五加果黃酮提取液，經旋轉蒸發儀真空濃縮后凍干，用50%乙醇配制成不同濃度的樣品溶液，進行自由基清除活性的測定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性的測定[15]取3.3 mL樣品溶液，加入配制好的0.5 mL濃度為1.0×10-5mol/L的DPPH無水乙醇溶液，搖勻，室溫避光反應30 min后于520 nm測定吸光度。自由基清除率計算公式如下：

清除率=[1-(Ds-Db)/Dc]×100%。

式中：Dc為對照吸光度；Ds為樣品吸光度；Db為樣品空白吸光度。

樣品活性的測定：將1 mL樣品溶液、3.2 mL蒸餾水、4.5 mL pH值為8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液混勻，然后按照上述相同的方法測定325 nm處的吸光度。自由基清除率計算公式如下：

清除率=(Dc-Ds)/Dc×100%。

式中：Dc為加入樣品前的吸光度；Ds為加入樣品5 min后的吸光度。

1.2.4.3 羥自由基(·OH)清除活性的測定[17]取濃度為60 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液各2 mL，搖勻混合，加入1.0 mL樣品溶液，加蒸餾水定容至20 mL，加入2 mL 6 mmol/L H2O2，反應10 min，在520 nm處測定吸光度。自由基清除率計算公式如下：

[1-(Ds-Db)/Dc]×100%。

式中：Dc為對照吸光度；Ds為樣品吸光度；Db為樣品空白吸光度。

2 結果與分析

2.1 超聲波法提取無梗五加果黃酮單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對黃酮提取的影響 從圖1中可看出，隨著乙醇濃度的升高，黃酮提取量增加，當乙醇濃度為30%時，提取量達到最大值；隨著乙醇濃度繼續增加，水溶性黃酮溶解性降低，黃酮提取量隨之下降。

2.1.2 超聲提取時間對黃酮提取的影響 從圖2可以看出，隨著提取時間的增加，黃酮提取量逐漸增加，在40 min時達到最大值；隨著提取時間繼續增加，提取量反而下降，原因可能是提取出的黃酮在超聲波的作用下被逐漸分解。

2.1.3 提取劑用量對黃酮提取的影響 從圖3可以看出，隨著提取劑用量的不斷增加，黃酮的提取量也不斷增加，當提取劑用量為50 mL/g時，黃酮提取量達到最大值；隨著提取劑用量繼續增加，黃酮提取量有所下降，當提取劑用量在50～90 mL/g 范圍內時，提取量較高。

2.2 超聲波法提取無梗五加果黃酮響應面試驗設計與結果

將表3試驗結果進行回歸擬合，得到回歸方程如下：Y=40.85+0.59A+2.40B-9.32C-0.99AB-0.15AC-1.43BC-3.19A2-1.77B2+2.15C2。

表3 響應面分析試驗設計及結果

由表4方差分析及顯著性檢驗結果可知，該回歸方程模型影響極顯著(P<0.000 1)，回歸模型的R2=0.984 6，說明該模型能夠解釋98.46%的變化，回歸方程失擬項檢驗不顯著(P=0.064 5>0.05)，說明所得回歸方程有較好的準確度和可靠性，擬合度良好，可用該模型分析和預測無梗五加果黃酮超聲提取的結果?；貧w方程系數的顯著性分析結果表明，各因素對黃酮提取量的影響程度排序為提取劑用量>超聲提取時間>乙醇濃度(C>B>A)，方程的一次項提取時間(B)、料液比(C)對響應值的影響極顯著；二次項A2對總黃酮含量的影響極顯著，二次項B2、C2對響應值的影響顯著。綜上所述，單個試驗因素對黃酮提取量的影響并非只是線性關系。

2.3 超聲波法提取無梗五加果黃酮響應曲面圖與等高線圖分析

由圖4可知，隨乙醇濃度的不斷增大，黃酮提取量先增高后下降(圖4-a、圖4-b)；而當提取劑用量不斷增加時，黃酮提取量不斷下降(圖4-b、圖4-c)； 黃酮提取量隨著超聲提取時間的不斷增加，則呈現先增加后趨于平穩的趨勢(圖 4-a、圖4-c)。由此可見，各因素之間沒有明顯的交互作用。如果某個響應曲面坡度非常陡峭，則表明響應值對于處理條件的改變非常敏感[14]。從響應曲面坡度來看，黃酮提取量對于提取劑用量的改變最敏感，其次是超聲提取時間，而黃酮提取量對乙醇濃度的改變不敏感，與表4回歸模型方差分析結果一致。

表4 回歸模型方差分析

注：“*”表示在0.05水平影響顯著；“**”表示在0.01水平影響顯著。

利用響應面分析得到最佳提取工藝預測值，即乙醇濃度為29.21%，提取時間為40 min，料液比為1 g ∶50 mL，此時黃酮提取量理論值可達54.37 mg/g。將此提取工藝運用到實際操作當中，優化參數，即提取濃度為30%，提取時間為 40 min，料液比為1 g ∶50 mL，時，實際的黃酮提取量為 54.21 mg/g，達到預期值的99.71%。

2.4 無梗五加果黃酮提取物組成的高效液相色譜分析

本試驗采用梯度洗脫條件對無梗五加果黃酮組分進行了分離。圖5顯示，標準品蕓香苷、金絲桃苷、槲皮素的出峰保留時間分別為26.602、27.343、42.873 min。由圖6可以看出，樣品在保留時間分別為26.704、27.450、42.977 min處出峰，與標準品蕓香苷、槲皮素、金絲桃苷出峰時間基本一致。馮勝等采用單一成分測定的高效液相色譜法分別對無梗五加果中的蕓香苷、槲皮素和金絲桃苷含量進行了測定，結果表明，無梗五加果中含有金絲桃苷、蕓香苷、槲皮素，但后兩者的含量較低[18]， 從本試驗的液相色譜圖出峰結果看， 與其研究結果相同。

2.5 無梗五加果黃酮提取物的自由基清除活性的測定和比較

由圖7可以看出，在所考察濃度范圍內，無梗五加果黃酮提取物對羥自由基的清除活性最強，對DPPH自由基的清除活性則隨其濃度增加而明顯增強，當濃度較低時，其自由基清除活性為三者中最弱的，但當濃度接近0.4 mg/mL時，其自由基清除活性已超過對超氧陰離子自由基的清除活性。

3 結論

本研究在單因素試驗基礎上，采用響應面法對無梗五加果黃酮類化合物超聲波提取工藝進行了參數的優化，并結合實際試驗操作條件，最終確定最優的操作工藝參數為乙醇濃度30%，料液比1 g ∶50 mL，提取時間40 min，實際提取量為54.21 mg/g，達到預期值的99.71%。

對于提取后的無梗五加果黃酮提取物，通過與標準品(對照)保留時間進行比較，利用高效液相色譜法進行定性分析，確定其黃酮類組成包括蕓香苷、金絲桃苷、槲皮素。

在所考察濃度范圍內(0.05～0.4 mg/mL)，無梗五加果黃酮提取物對羥基自由基的清除活性最強，對DPPH自由基的清除活性隨濃度增加而增強的趨勢最為明顯。