蘇州不同果園土壤原核微生物的群落結構和多樣性

錢 瑋， 陳宏偉， 胡翠英， 邱業先

(蘇州科技大學，江蘇蘇州 215009)

土壤微生物是農業生態系統中重要組成部分，主要包括細菌、真菌和古菌等，它們影響許多重要的生態過程，如植物對養分的獲取，氮、碳、磷等物質的生物地球化學循環，并且對周圍的土壤壞境十分敏感[1-2]。土壤微生物數量、群落組成及分布等指標已被公認為土壤生態系統變化的預警及敏感指標，目前土壤微生物多樣性及功能的研究已引起國內外學者的極大關注[3]。

相關學者前期通過T-RFLP、PLFA、DGGE等手段分析了土壤細菌的多樣性，并探討施肥方式對細菌群落結構的影響[4-7]。但上述研究方法靈敏度有限，只能分析豐度大于1%的優勢類群，而高通量測序技術可分析豐度大于1‰的類群，能較全面地反映微生物的群落結構，成為微生態學研究的主要方法[8]。

筆者運用高通量測序技術結合多元統計分析方法，分析了蘇州地區果園土壤微生物群落結構以及微生物與土壤環境因子之間的關聯，為研究不同土地利用方式對土壤生態系統的影響積累了有價值的試驗資料，可為土壤生態系統的修復和健康狀況評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品采集 取樣地點位于江蘇省蘇州市金庭鎮某農場(31°11.4′～31°11.6′ N，120°29.8′～120°30.2′ E)，金庭鎮位于中國第二大淡水湖——太湖之中，是我國淡水湖泊中最大的島嶼，該地屬北亞熱帶濕潤性季風氣候類型，年平均溫度約16 ℃，降水量在1 000～15 000 mm，加上太湖水體調節作用，成為國家級現代農業示范園區。農場內主要種植茶樹、枇杷、柑橘、蔬菜等經濟作物，于2015年11月在農場的茶樹林、枇杷林、柑橘林、青菜地、野草地內分別設置10 m×10 m樣方，在樣方內5點取樣，每份樣品設置3個重復。采集0～10 cm的土壤，去除植物殘體和石塊，混合均勻后分成2份，置于無菌袋中帶回實驗室-20 ℃保存，1份用于測定理化指標，1份用于微生物多樣性研究[9]。

1.1.2 試劑 PowerSoil DNA提取試劑盒，美國MoBio；PCR擴增試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR引物等均購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機，GL-20G-Ⅱ，上海安亭生產；小型臺式高速離心機，5417R，德國艾本德生產；凝膠成像分析儀，Universal Hood Ⅱ，美國伯樂生產；PCR擴增儀，5332，德國艾本德生產；恒溫水浴鍋，HH·S21-4-S，上海精宏生產；高壓蒸汽滅菌鍋，YXQ-LS-50SII，上海博訊生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品的理化分析 土壤含水率采用烘干恒重法測定；pH值采用電極法測定；有機質采用灼燒法測定；速效鉀采用醋酸銨浸提-原子吸收光度法測定；速效磷采用鹽酸-硫酸浸提-鉬藍比色法測定；速效氮采用堿解蒸餾法測定；氨氮采用氯化鉀浸提-納氏試劑比色法測定[10]。

1.2.2 土壤總DNA提取、擴增和高通量測序 使用PowerSoil DNA提取試劑盒，按照操作手冊提取土壤中總DNA，采用引物515F(5′- GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′ )和909R(5′- CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′ )擴增原核生物16S rDNA V4-V5區[11-12]。25 μL PCR反應體系中包含0.25 μL ETaq酶 (5 U/μL)，2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)，1 μL模板DNA(20 ng/μL)，1 μL 引物F(10 μmol/L)，1 μL引物R(10 μmol/L)，17.5 μL無菌蒸餾水。PCR反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共27個循環；然后72 ℃ 延伸5 min。3份重復的PCR產物混勻純化后構建DNA文庫，然后由上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Illumina公司Miseq 2×250 bp平臺進行測序。

1.2.3 測序數據處理和統計分析 高通量測序結果通過QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology) pipeline[13]進行分析。原始數據使用FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)進行質檢，去除低質量片段后的成對雙末端序列根據重疊區融合成一條序列，根據barcode標簽判斷序列來源并區分樣品。然后利用Usearch算法[14]在97%相似度水平[15]下進行OUT(operational taxonomic unit)聚類，每個OUT的代表序列依據silva數據庫采用RDP classifier[16]按照界、門、綱、目、科、屬、種分配分類單元。然后用QIIME軟件計算各樣品的α-多樣性和β-多樣性。典范對應分析(CCA)運用R軟件Vegan程序包完成[17]。

本研究其他的數據分析使用SPSS 15.0完成，圖形制作使用R 3.1.2軟件(R-Development Core Team，2014)完成。

1.2.4 登陸號 本研究所涉及土壤樣本16S rDNA序列已經提交至NCBI SRA數據庫，登陸號分別為SUB1054781、SUB1054794、SUB1054825、SUB1054826、SUB1054827。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

土壤樣品的理化性質檢測結果見表1，枇杷樹、橘樹土壤中有機質含量顯著高于其他樣本，枇杷樹土壤中速效磷、速效鉀顯著高于其他土壤，分別為271.5、96.4 mg/kg，而茶樹土壤中速效鉀、速效氮分別為31.7、12.3 mg/kg，顯著低于其他樣本。橘樹、茶樹、枇杷樹這3種木本植物根際土壤呈酸性，生長草本植物的土壤呈弱堿性。

表1 不同土壤樣品理化性質比較

注：表中數據為平均值±標準誤；同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。A、B、C、D、E分別表示橘樹土、茶樹土、枇杷樹土、青菜土、草地土，表2、圖1、圖2、圖3同。

2.2 土壤原核微生物群落多樣性分析

對5個樣品進行高通量測序，共得到2.16 GB原始數據，經過質控、拼接和過濾處理后共獲得179 831條有效的16S rDNA序列，序列長度分布在390～426 bp，平均長度為 396 bp，與擴增目的片段長度吻合。從圖1可以看出，隨著測序讀條數的增加，曲線趨近于平坦，說明樣本中大部分物種信息(OUT)已經得到，能夠滿足后續分析的需要，而繼續增加測序數據量只會產生少量新的物種。為消除各樣本間序列總數差異對后續分析的影響，把各樣本序列數抽平到15 000條。然后在97%序列相似性水平下劃分OUT，刪除豐度小于總序列數0.01%的OUT，共獲得960個OTU。5個土壤樣品中平均含有570個OUT，其中青菜地土壤中原核微生物種類最多，為705個OUT；而茶樹林土壤中微生物種類最少，為385個OUT。

不同樣品中原核微生物群落的α-多樣性分析結果見表2，由Chao指數和Ace指數可見枇杷樹和青菜土壤樣品中微生物種類最多，茶樹和草地土壤中微生物種類較少。就Shannon指數而言，枇杷樹土壤中微生物多樣性最高，為 6.53；而茶樹土壤中微生物多樣性最低，為4.61；橘樹、青菜和草地土壤的微生物多樣性介于二者之間。

表2 不同土壤樣品中原核微生物群落α-多樣性指數

2.3 土壤原核微生物群落組成

從圖2-A可以看出，蘇州果園土壤中豐度較高的門為變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門，平均豐度分別為42.6%、22.0%、9.3%、7.2%、4.6%。其中枇杷樹、青菜土壤中擬桿菌含量為16.9%，明顯高于其他樣品的 4.1%，但它們的酸桿菌含量為15.7%，低于其他土壤的 26.1%。草地土壤中屬于古菌域的泉古菌門豐度為16.9%，遠高于另外4個樣品的1.5%。

從圖2-B可以看出，土壤中豐度較高的科為黃色單胞菌科、酸桿菌科、Chitinophagaceae、紅螺菌科、華桿菌科，平均豐度分別為10.4%、9.8%、9.3%、6.8%、6.6%。屬于泉古菌門的SAGMA-X科微生物在草地樣本中豐度為24.87，明顯高于橘樹和茶樹樣本的3.7%，而枇杷樹、青菜土壤中SAGMA-X科屬于低豐度微生物，平均豐度為0.03%。

選取平均豐度前100的OUT，根據分類信息和各OUT在不同樣本中的分布，繪制土壤中原核微生物系統發生學分布圖(圖3)。從綱水平來看，土壤微生物主要分布于酸桿菌綱、擬桿菌綱、γ-變形菌綱和β-變形菌綱。從不同樣本群落組成來看，枇杷樹和青菜土壤中Cytophagaceae、黃桿菌屬、厭氧繩菌綱和β-變形菌綱的豐度高于其他樣本，但纖線桿菌綱、酸桿菌科、α-變形菌綱、γ-變形菌綱和泉古菌門微生物含量低于其他樣本。

2.4 環境因子對群落結構的影響

為進一步分析環境因子對土壤微生物群落的影響，本研究在OUT水平進行了群落結構與土壤理化指標的典范對應分析(CCA)。從圖4可以看出，第一軸對樣本間物種差異解釋度為66.1%，第二軸解釋度為18.6%，總體解釋度超過80%。，根據環境因子的軸長，可以判斷pH值和速效氮含量對土壤微生物群落結構影響大于其他因子。速效氮與OTU5、6、9有較強的正相關性，與其他OUT呈負相關，而OTU5、6、9也是樣本C、D的代表微生物類群。pH值與OTU2有較強的正相關，而與OTU8、1呈負相關，即酸性環境有助于提高OTU8和1在群落中的豐度，最終形成樣本A、B類似的群落結構。這些主要OUT的代表序列提交至NCBI，BLAST比對結果見表3，表明多數OTU 代表序列與 GenBank收錄序列相似度低于97%，可能為一些分類地位尚不明確的微生物，還需要進一步研究[18]。

表3 主要OUT代表序列BLAST比對結果

3 討論與結論

以宏基因組學方法探究了蘇州果園不同土地利用方式對土壤微生物群落結構的影響，發現種植橘樹和茶樹的土壤微生物群落結構相似，種植枇杷樹和青菜區域的群落組成基本一致，但是這些植物的生長都引起了土壤微生物群落的較大變化(相比草地而言)。最主要表現在于草地土壤中豐度較高的泉古菌門微生物在種植土壤中豐度大大降低，由16.9%降至1.5%，但是該類群微生物在土壤生態系統中的作用以及其豐度降低對生態系統的影響還需要進一步研究[18]。結合環境因子與群落結構的典范對應分析表明，土壤pH值和速效氮的含量是影響原核微生物群落組成的主要因子，但是這些環境因子的變化是種植方式(施肥或者松土等)不同引起的，還是由于植物和共生微生物協同作用引起的，目前仍是土壤微生物生態學研究的熱點問題[19-20]。