1株秸稈降解高溫菌的篩選、鑒定及堆肥應用

文亞雄， 譚石勇， 邱 堯， 劉 備， 楊麗麗， 劉 翔， 楊梅玉

(湖南泰谷生物科技股份有限公司農業生物技術研究院/農業部植物營養與生物肥料重點實驗室，湖南長沙 410300)

作物秸稈是農業生產中產生的一種大量廢棄物，我國是世界秸稈產量最高的國家之一，占全世界秸稈總量的30%左右[1]。我國每年產生的秸稈約有7億t，根據其氮、磷、鉀養分含量計算，相當于350多萬t氮肥，800多萬t鉀肥，80多萬t磷肥[2]。將秸稈還田是農田土壤有機質的重要來源，也可節約大量化肥的施用，然而我國秸稈還田率還不足50%，在國家明令禁止露天焚燒秸稈以前，約97%的秸稈被焚燒、堆積或者遺棄，極大地造成了資源的浪費，同時也嚴重污染了環境[3-4]。秸稈還田方式包括覆蓋還田、粉碎還田、堆肥還田及過腹還田等[5]，其中，前3種還田方式適用于大量秸稈的處理，但覆蓋還田和粉碎還田屬于直接還田，秸稈腐解速度慢，還易引發病蟲害[6-7]。通過堆肥方式將秸稈制成有機肥還田，不但能大量處理秸稈，還能加快秸稈的腐解，提高肥效，改良土壤，培肥地力，是解決我國當前有機肥短缺的有效途徑。

秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素構成，約占秸稈干質量的80%，其中纖維素與木質素較難被分解[8]。在秸稈細胞中，木質素、纖維素與半纖維素等交聯沉積在細胞壁中，木質素還可通過多糖橋交聯影響微生物降解纖維多糖。細菌因其體積小、營養吸收面大、物質交換快等特點，常被用于堆肥生產[9]。針對秸稈中纖維素含量較高。堆肥過程中堆體內部溫度較高的特點，本研究通過篩選耐高溫產纖維素酶的微生物，進行秸稈崩解及堆肥試驗，以期篩選出簡單高效的秸稈堆肥菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 平菇菇渣，以木屑為主要原料，在自然堆積過程中可升溫至60 ℃以上。

1.1.2 培養基 分離培養基用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。富集培養基：秸稈10.0 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.5 g、蒸餾水1 000 mL。純化培養基營養瓊脂(NA)培養基。羧甲基纖維素(CMC)鑒別培養基：CMC-Na 7.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、NaCl 1.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值自然。基礎發酵培養基：葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO42.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值自然。秸稈崩解培養基：水稻秸稈10.0 g，豆粕/尿素5.0 g，KH2PO42.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

微生物及堆肥試驗于2016年在湖南瀏陽農業部植物營養與生物肥料重點實驗室進行。

1.2.1 菌株篩選 稱取10.0 g菇渣樣品置于滅菌的 90.0 mL 富集培養基中，40 ℃搖床培養振蕩24 h，采用稀釋涂布法于 40 ℃ 條件下分離細菌。所得菌株分別點接于CMC鑒別培養基上，40 ℃ 恒溫培養。CMC鑒別培養基培養的菌株菌落出現后，倒入1.0 g/L剛果紅溶液染色1 h，倒出染色液，用 1.0 mol/L 的NaCl沖洗脫色，觀察菌落周圍有無纖維素水解圈，并測量水解圈直徑，將具有分解纖維素能力的菌株編號保存備用。

將以上保存菌株分別接種于2種不同氮源(豆粕、尿素)的秸稈崩解培養基中，35 ℃振蕩培養10 d，培養完成后過濾，將固體殘渣用蒸餾水沖洗，除去菌體，105 ℃烘干后稱質量，以不接菌為對照，采用失質量法計算秸稈降解率[10]。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態學特征及部分生理生化特性 菌株純化后，觀察菌株在純化培養基上的菌落特征，并對細菌菌體進行革蘭氏染色鑒別，通過顯微鏡觀察菌株的形態特征，并根據《伯杰氏系統細菌手冊》(第2版)研究細菌的部分生理生化特征。

1.2.2.2 16S rDNA鑒定 將純化得到的菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，細菌測序用通用引物16S F(5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S R(5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′)。將獲得的細菌DNA序列分別輸入到EzBioCloud中，用Identify程序與數據庫中的所有序列進行比較分析。并利用MEGA5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.3 發酵培養基初步優化

1.2.3.1 菌株生長曲線測定 將活化菌株以2%的接種量分別接入裝有50 mL滅菌基礎發酵培養基的250 mL錐形瓶中，于35 ℃，160 r/min條件下搖瓶發酵，發酵培養期間每隔 2 h 取發酵液樣品，測定其吸光度(D600 nm)。換算倍數后以其代表發酵液菌體濃度，并以發酵時間及菌體濃度繪制菌株生長曲線。

1.2.3.2 不同碳源對發酵液菌體濃度的影響 分別以 10.0 g/L 糊精、甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖替代基礎發酵培養基中的碳源進行發酵試驗，于搖床35 ℃，160 r/min搖瓶中發酵20 h，測定發酵液吸光度(D600 nm)，比較不同碳源對發酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.3 不同氮源對發酵液菌體濃度的影響 分別以 5.0 g/L 硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨、硫酸銨、尿素替代基礎發酵培養基中的氮源，以上述篩選的最佳碳源及濃度代替基礎發酵培養基中的碳源進行發酵試驗，于35 ℃，160 r/min 條件下搖瓶發酵20 h，測定發酵液吸光度(D600 nm)，比較不同氮源對發酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.4 不同無機鹽對發酵液菌體濃度的影響 分別以 2.0 g/L 磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸鎂替代基礎發酵培養基中的無機鹽，以上述篩選的最佳碳、氮源及濃度代替基礎發酵培養基中的碳、氮源進行發酵試驗，于35 ℃，160 r/min條件下搖瓶發酵20 h，測定發酵液吸光度(D600 nm)，比較不同無機鹽對發酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.5 不同無機鹽濃度對發酵液菌體濃度的影響 分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L磷酸二氫鉀替代基礎發酵培養基中的無機鹽，以上述篩選的最佳碳、氮源及濃度代替基礎發酵培養基中的碳、氮源進行發酵試驗，于35 ℃，160 r/min條件下搖瓶發酵20 h，測定發酵液吸光度(D600 nm)，確定合適的磷酸二氫鉀質量濃度。

1.2.3.6 不同碳氮比對發酵液菌體濃度的影響 分別以 10.0 g/L 淀粉，2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g/L酵母膏及上述篩選得到的最佳無機鹽及濃度替代基礎發酵培養基中的各對應組分，35 ℃，160 r/min搖瓶發酵20 h，測定發酵液吸光度(D600 nm)，比較不同碳氮比對發酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.7 最佳碳氮比下不同濃度碳氮源對發酵液菌體濃度的影響 將淀粉、酵母膏分別以(1)5.0、6.25 g/L；(2)10.0、12.5 g/L；(3)20.0、25.0 g/L；(4)30.0、37.5 g/L；(5)40.0、50.0 g/L；(6)50.0、62.5 g/L的濃度添加，無機鹽為上述篩選得到的最佳無機鹽及濃度，于35 ℃，160 r/min條件下搖瓶發酵20 h，測定發酵液吸光度(D600 nm)，確定各碳氮比下碳氮源的質量濃度。

1.2.4 秸稈堆肥驗證 堆肥炎癥試驗設置為處理1：玉米秸稈38.0 kg、菜粕2.0 kg、試驗菌劑；處理2：玉米秸稈38.0 kg、菜粕1.0 kg、尿素1.0 kg、試驗菌劑；CK：玉米秸稈38.0 kg、菜粕2.0 kg、市售EM菌劑。

堆肥菌劑：試驗菌劑為篩選得到細菌的發酵液，接種量以干物質計，細菌為2.5×1011CFU/kg；市售EM菌劑由滄州旺發生物技術研究所有限公司提供，接種量為2.4×1011CFU/kg。

將各物料及菌劑加水混勻，初始水分含量為60%。堆肥開始后，每天測定堆內溫度，定期翻堆，堆肥結束后測定各堆肥樣品的有機質含量，另各取10.0 g堆肥樣品，加水至 50.0 mL，振蕩1 h過濾，取濾液進行油菜種子發芽率試驗，以蒸餾水為對照，測定種子發芽率及發芽指數(GI)[11]。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

以CMC鑒別培養基從菇渣中分離到3株高溫產纖維素酶的細菌，將菌株分別接種于2種不同氮源的秸稈崩解培養基，35 ℃恒溫培養48 h，測量細菌，水解圈大小(水解圈直徑-菌落直徑，D-d)。從表1可以看出，3株細菌均具有不同程度的纖維素酶活性，可見明顯的水解圈，其中以G2水解圈最大。由圖1可知，3株細菌均對秸稈具有不同程度的降解效果，以豆粕為氮源的秸稈崩解效果優于以尿素為氮源的處理，其中G2以豆粕為氮源的秸稈降解率最高，達14.59%。

表1 不同菌株水解圈大小

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態學和相關生理生化特性 菌株G2在純化培養基平板上的菌落中間有凸起，白色，表面褶皺不規則，革蘭氏染色呈陽性。菌株G2相關生理生化特性見表2。

表2 G2相關生理生化特征

注：“+”“-”分別表示反應陽性、反應陰性；V-P表示乙酰甲基甲醇試驗；MR表示甲基紅試驗。

2.2.2 DNA鑒定 以細菌菌株G2基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA基因通用引物進行PCR擴增，成功擴增出長約1.3 kb的DNA片段，將細菌測序結果輸入到Ezbiocloud中進行Identify比對分析，從比對結果中選取同源性較高的菌株，用MEGA 5.0構建系統發育樹，結果(圖2)表明，G2與芽孢桿菌屬(Bacillus)的多個菌株具有同源性，其中與BacillussiamensisKCTC 13613的遺傳距離最近，同源性達99%。

2.3 發酵培養基初步優化

2.3.1 菌株生長曲線測定 從圖3可以看出，0～4 h為G2的生長停滯期；4 h以后進入對數生長期，菌體數量增長快速；14 h 后進入穩定期，菌體濃度穩定，變化小；24 h 后進入衰亡期，菌體濃度開始下降。由此可知，種子液發酵時間可選擇為12～14 h，該時期細菌生長旺盛，且菌體濃度較高；而測定最高菌體濃度可選擇發酵時間為16～24h，該時期菌體濃度最高且穩定。

2.3.2 不同碳源對G2發酵液菌體濃度的影響 從圖4可以看出，在糊精、甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖6種碳源中，以淀粉作碳源時，G2菌體濃度最高，因此選擇淀粉作為發酵培養基的碳源。

2.3.3 不同氮源對G2發酵液菌體濃度的影響 從圖5可以看出，有機氮源處理G2的菌體濃度明顯高于無機氮源，其中以酵母膏作氮源時，G2菌體濃度最高，因此選擇酵母膏作為發酵培養基的氮源。

2.3.4 不同無機鹽對G2發酵液菌體濃度的影響 從圖6可以看出，不同無機鹽對G2菌體濃度的影響差異較小，其中以磷酸二氫鉀作無機鹽時，細菌G2菌體濃度最高，因此選擇磷酸二氫鉀作為發酵培養基的無機鹽。

2.3.5 不同無機鹽濃度對G2發酵液菌體濃度的影響 從圖7可以看出，磷酸二氫鉀濃度為1.0 g/L時，G2菌體濃度最高，而隨著磷酸二氫鉀添加量的提高，菌體濃度逐漸降低，因此磷酸二氫鉀濃度的最佳為1.0 g/L。

2.3.6 不同碳氮比對G2發酵液菌體濃度的影響 從圖8可以看出，隨著碳氮比的降低，G2菌體濃度呈先上升后下降的趨勢，當碳源、氮源濃度分別為10.0、12.5 g/L時，G2菌體濃度最高，因此選擇該比例作為發酵培養基的碳氮比。

2.3.7 最佳碳氮比下不同濃度碳、氮源對G2發酵液菌體濃度的影響 從圖9可以看出，隨著碳、氮源濃度的增大，G2菌體濃度呈先上升后下降的趨勢，當碳源、氮源濃度分別為30.0、37.5 g/L時，G2菌體濃度最高D600 nm=10.395，較基礎發酵培養基發酵濃度(D600 nm=4.77)提高了117.92%，因此選擇該比例作為發酵培養基的碳、氮源濃度。由此得出，初步優化的G2發酵培養基為可溶性淀粉 30.0 g/L，酵母膏 37.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L。

2.4 秸稈堆肥驗證試驗

選取降解秸稈效果最佳的G2進行不同秸稈堆肥試驗，測定堆內溫度、有機質含量及腐熟后種子發芽率。

2.4.1 溫度 好氧堆肥過程一般可分為升溫期、高溫期、降溫期3個時期。從圖10可以看出，不同試驗處理堆內溫度表現出上升、平穩、下降的趨勢，試驗處理在1 d內均達到了 50 ℃ 及以上，第2天不同處理均達到了60 ℃以上，60 ℃以上溫度持續時間均達到5 d及以上，符合堆肥無害化處理的標準。處理1、處理2第1天溫度分別達到56、50 ℃，分別較對照處理高14、8 ℃；處理1最高溫度達68 ℃，較其他2處理高3 ℃，高溫持續時間也較其他處理長1 d。處理1與對照處理堆肥物料相同，而堆肥菌劑不同，說明試驗菌劑較該市售菌劑更適用于玉米秸稈堆肥；處理1與處理2所用氮源不同，說明有機氮源更適合于微生物生長，這也進一步驗證了秸稈崩解試驗的結論。

2.4.2 理化指標 從表3可以看出，不同處理的有機質含量均有減少，說明堆肥原料中的部分有機質被微生物分解，其中，處理1堆肥結束后有機質含量最低，說明試驗菌劑對玉米秸稈的降解能力優于市售菌劑，但使用無機氮源時效果稍差。GI常用于評價堆肥腐熟度，能直接反應堆肥的腐熟狀態，當GI指數達到80%～85%時，表明堆肥對植物沒有毒性，已經腐熟[12-13]。從表4可以看出，處理1的GI指數已大大高出腐熟標準，說明腐熟秸稈已完全腐熟，且對植物沒有毒性[14]，此外試驗處理的種子平均根長平均值大于對照處理，說明該腐熟秸稈的浸提液可促進植物的生長。

表3 不同處理有機質含量

表4 種子發芽率及GI指數

3 討論

秸稈的資源化利用已成為國家提出的“一控、兩減、三基本”目標之一，秸稈堆肥是秸稈資源化利用的重要方法，將越來越受到重視。目前，針對農作物秸稈堆肥的研究主要集中在工藝優化和篩選降解秸稈的高溫菌等方面[15]，尤以產木質纖維素酶高溫菌的篩選多見報道。高溫菌在堆肥過程中代謝快、活性高、酶的熱穩定性高，可有效提高堆肥效率[16-17]。秸稈的主要成分包括纖維素、半纖維素及木質素，該類物質較難降解，篩選產相關酶系的微生物可有效分解秸稈中的難降解成分，加快堆肥的腐熟，因此，篩選該類高溫菌一般以酶活性為篩選條件。但由于酶活性的測定方法、條件以及酶活性單位的定義等比較多樣化，因此不同報道中的菌株酶活性參考性不大，而酶活性的測定誤差也較難控制，且對多菌復合的情況并不適用，不能很好反應菌株對秸稈降解的作用能力。失質量法是將微生物接入以秸稈為碳源的培養基中培養，培養后計算秸稈的質量損失，得出秸稈的降解率。該方法簡單直接，可以直觀反映出微生物對秸稈的降解能力，并適用于多菌復合以及復合菌群的篩選，在工業生產上，可將失質量法得出的結果直接用于小試生產，可節約成本及時間。

發酵條件優化試驗常用的設計方法有正交試驗設計法、響應面設計法等，一般是由單因素試驗確定試驗因素與水平，后經多因素設計試驗得出多因素試驗條件下的最優組合。而常規的單因素試驗確定的碳、氮源濃度，并未考慮C/N的問題，確定最佳C、N濃度只是在基礎培養基的基礎上進行的，確定碳源氮源濃度的試驗中C/N各不相同，所得結果可能不是最優濃度。如本試驗結果，以最佳C/N進行濃度試驗，相同C/N不同濃度的C、N存有優化空間，所得結果應為最佳濃度。如本試驗不進行該項試驗，則單因素優化的結果為C、N最佳濃度為10 g/L左右，與最佳結果相差較大，如進行正交優化，則須進行多次試驗或不能得出最佳結果。本試驗只對發酵培養基進行了初步優化，若要進行工業化生產，則應進一步對發酵條件等進行深入研究。