哲羅鮭（Hucho taimen）卵巢發育過程中下丘腦-垂體-性腺軸（HPG軸）相關因子的動態變化

任廣明，佟廣香，張永泉，徐黎明，盧彤巖，尹家勝

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類的生殖過程是在下丘腦、腦垂體、性腺組成（稱下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPG軸）的神經與內分泌系統整體控制下進行[1]。中樞神經系統接受外界環境因子（如食物、光周期、溫度、鹽度、性信息素等）的刺激后，激發神經分泌細胞釋放小分子神經介質傳遞給下丘腦，使下丘腦分泌合成促性腺激素釋放激素（GnRH），促使垂體分泌促性腺激素（GtHs），即促濾泡激素（FSH）和促黃體激素（LH）[2-4]。FSH與LH在不同階段刺激性腺產生多種性類固醇激素（雄激素、雌激素和孕激素等），具有調控配子最終成熟、促使卵母細胞或精子最后成熟、刺激排放的作用[1]。性類固醇激素除了調節卵黃和精子的發生，還能在下丘腦和垂體水平上通過正反饋刺激性未成熟魚類GnRH和GtHs的合成與釋放，啟動HPG軸的功能，刺激性腺發育。可見，魚類的性腺發育依賴于HPG軸有節奏地相互協調與制約，是神經內分泌系統調控下多種激素共同作用的生理過程。

哲羅鮭Hucho taimen是鮭形目鮭科哲羅魚屬的一種大型珍稀冷水性經濟魚類。隨著全人工繁育和苗種馴化關鍵技術的突破，哲羅鮭養殖業迅速發展[5]。近年來，有關哲羅鮭稚魚的生長、營養需求、胚胎與仔魚發育、肌肉營養價值[6-9]等方面取得了一定進展，但對哲羅鮭生殖調控機制的認識仍很匱乏。隨著養殖業的快速發展，如親魚卵巢發育不良、產卵效率和孵化率下降等問題凸顯，嚴重制約哲羅鮭苗種生產，阻礙養殖業健康、可持續發展。神經內分泌激素協同、穩定地調控是促使雌親魚性腺發育成熟與產卵的關鍵。因此，為了深入了解HPG軸對哲羅鮭卵巢發育的調控作用，本試驗測定卵巢處于不同發育期的7齡雌哲羅鮭血清中雌二醇（E2）與睪酮（T）的含量，檢測下丘腦GnRH、垂體FSH與LH及肝臟卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vtg）mRNA表達水平的變化，同時分析生殖激素基因、性腺指數（GSI）和性類固醇激素的相關性關系，以期為揭示哲羅鮭生殖調控機制提供新的思路和基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用哲羅鮭親魚來自黑龍江水產研究所渤海冷水魚試驗站，挑選體質健壯、規格和體質量基本一致的同一批全人工培育的7齡雌哲羅鮭，全長70～80cm，體質量 4 500～4 700g。

1.2 采樣

定期選取卵巢處于不同發育期的7齡雌性哲羅鮭，以MS-222麻醉（300mg/L）后尾部采血，血液4℃靜置后于2 000r/min離心30min，收集血清于-20℃保存，用于測定血清中E2與T含量。試驗魚逐尾采血后，分別采集肝臟與性腺組織，將采集到的性腺組織快速稱重用于計算GSI[100%×性腺質量/（體質量-性腺質量）]。打開試驗魚頭顱，采集位于間腦后側丘腦下方的下丘腦及丘腦末端垂體窩內垂體組織。將采集到的肝臟、性腺、下丘腦及垂體組織置于液氮中冷凍后貯存于-80℃低溫冰箱中備用。

1.3 血清中E2與T含量的測定

嚴格按照上海酶聯生物科技有限公司試劑盒的說明書，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清樣品中E2和T的含量。根據標準曲線計算血清樣品中激素的含量，每個處理設置3個平行。

1.4 基因的實時熒光定量PCR檢測

參照 Trizol Reagent（Invitrogen，USA）說明書的方法提取下丘腦、垂體與肝臟組織RNA。采用多功能酶標儀檢測RNA的濃度與純度；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用OneStepSYBRPrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit（TaKaRa，Japan）試劑盒測定基因表達水平變化。具體過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。根據GenBank上GnRH（大西洋鮭，Salmo salar）、LH（虹鱒，Oncorhynchus mykiss）、FSH（大西洋鮭，Salmo salar）、Vtg（大西洋鮭，Salmo salar）的基因序列，利用Premier 5.0設計熒光定量PCR特異引物，引物大小為100～150bp，引物序列見表1。以管家基因β-actin（亞東鮭，Salmo trutta fario）作為內標基因，用比較 CT 法（ΔΔCT）分析數據，取3次重復的平均值。

表1 哲羅鮭生殖激素基因熒光定量引物Tab.1 Primers for quantitative real-time PCR analysis of reproductive hormones in taimen

1.5 數據分析

GSI與性類固醇激素含量等數據用平均值±標準差（Mean±SD）表示，對GSI、血清性類固醇激素、相關激素mRNA表達水平分別進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。用SPSS19.0軟件對各指標進行相關性分析，P＜0.05差異顯著。

2 結果與分析

2.1 卵巢發育分期與GSI

以組織切片中觀察到的占優勢的卵細胞的發育期作為性腺的發育分期[10]。據此將采集到的哲羅鮭卵巢發育過程分為：Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期早期、Ⅳ期中期、Ⅳ期晚期、Ⅴ期早期、Ⅴ期中期。哲羅鮭不同發育期的卵巢GSI指數變化見圖1。由圖1可知，不同時期內卵巢GSI指數變化差異顯著（P＜0.05）。Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期中期卵巢的GSI相對較低（＜5），Ⅳ期末期和Ⅴ期早期卵巢GSI明顯上升至（7.91±1.64）%，至Ⅴ期中期卵巢時達（8.43±1.56）%。

圖1 哲羅鮭不同發育期卵巢的性腺指數Fig.1 Gonado-somatic index of ovary at different developmental stages in taimen

2.2 下丘腦GnRH mRNA在卵巢不同發育時期的表達

由圖2-A可知，哲羅鮭產卵后（Ⅱ期卵巢）下丘腦GnRH mRNA的表達水平仍較高，隨后（Ⅲ期）其表達量顯著下降（P＜0.05）；GnRH mRNA在卵巢發育至Ⅳ期時，其表達水平呈現先升高（Ⅳ期早期）后降低趨勢（Ⅳ期中期、Ⅳ期晚期）（P＜0.05）；卵巢發育至Ⅴ期中時，GnRH mRNA表達水平急劇升高，顯著高于各階段（P＜0.05）。

2.3 垂體FSH與LH mRNA在卵巢不同發育時期的表達

Ⅱ期卵巢時，垂體FSH mRNA的表達量較低；隨著卵巢發育至Ⅲ期，FSH mRNA表達量達到較高水平，隨后顯著下降（P＜0.05）（圖2-B）。卵巢發育到Ⅳ期中期，FSH mRNA表達水平再一次緩慢升高，在Ⅴ期時達峰值，隨后顯著下降至Ⅳ早期表達水平。由圖2-C可知，在卵巢發育過程中垂體LH mRNA表達水平呈波動變化趨勢，與FSH mRNA變化趨勢相似。產卵后LH mRNA的表達水平較低；Ⅲ期時，表達量達峰值，隨后顯著下降（P＜0.05）。Ⅳ期時垂體LH mRNA的表達水平較低。Ⅳ晚期時，LH mRNA表達水平再一次呈現顯著升高趨勢，至Ⅴ早期表達水平迅速下降。

2.4 肝臟Vtg mRNA在卵巢不同發育時期的表達

如圖2-D所示，Ⅱ期和Ⅲ期時，肝臟VtgmRNA表達量較低（P＜0.05）。Ⅳ期中期時，肝臟VtgmRNA表達量最高，隨著卵巢的不斷發育，Vtg mRNA的表達顯著下降至Ⅱ期和Ⅲ期卵巢水平（P＜0.05），不同發育時期差異顯著（P＜0.05）。

2.5 血清E2與T在卵巢不同發育期的含量變化

如圖3-A所示，卵巢在Ⅱ期和Ⅲ期時，哲羅鮭血清中E2含量維持在較高水平；隨著卵巢的發育，血清E2的含量顯著降低，Ⅳ期早期時降至（13.93±0.14）pmol/L（P＜0.05）；Ⅳ期中期、晚期時，血清 E2含量保持在15.21～15.43pmol/L，卵巢發育至Ⅴ期早期時血清E2含量有所下降，降至（14.38±0.14）pmol/L；進入Ⅴ期中期時，血清E2含量逐漸升高至Ⅱ期和Ⅲ期卵巢時水平。卵巢在Ⅱ期和Ⅲ期時，血清T含量維持在60pg/mL左右（圖3-B），在Ⅳ期早期其含量顯著下降到（53.64±1.61）pg/mL，隨后T含量顯著升高，在Ⅳ期中期達到最高；進入Ⅴ期血清T含量顯著下降；Ⅴ期中期血清T含量有所升高，但與Ⅳ期早期差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 相關性分析

圖2 哲羅鮭下丘腦GnRH mRNA（A）、垂體FSH（B）與LH（C）mRNA和肝臟Vtg mRNA（D）在卵巢不同發育期的表達Fig.2 Expression of GnRH mRNA in hypothalamus（A）,pituitary FSH（B）and LH（C）mRNA and liver Vtg mRNA（D）of taimen during the ovarian development

圖3 卵巢處于不同發育期的哲羅鮭血清E2與T的含量變化Fig.3 Changes in serum E2（A）and T（B）levels of taimen during the ovarian development

表2 生殖相關因子與性腺指數相關性分析Tab.2 Correlation analysis between reproductive factors and GSI

哲羅鮭卵巢發育過程中，GSI與下丘腦GnRH mRNA表達水平呈顯著正相關關系，而與血清T含量呈顯著負相關關系（P＜0.05）。血清T含量與肝臟Vtg mRNA表達水平存在極顯著的正相關關系（P＜0.01）。下丘腦GnRH mRNA表達水平與垂體FSH mRNA表達水平呈極顯著負相關（P＜0.01），而垂體FSH mRNA表達水平與LH mRNA表達水平呈顯著正相關關系（P＜0.05）。

3 討論

HPG軸作為核心的神經和內分泌系統主導著魚類性腺發育過程中整個過程。在性腺發育及配子生成前期，感覺器官把外界的刺激通過神經聯系傳遞到下丘腦，促使下丘腦分泌細胞的合成與分泌GnRH[1]。GnRH是HPG軸的關鍵神經內分泌調節因子，其mRNA表達水平在性腺發育周期內不斷地變化，與性腺發育呈正相關的規律。已有研究報道，GnRH mRNA表達水平在圓斑星鰈Verasper variegatus[11]、虹鱒 Oncorhynchus mykiss[12]、平鲉 Sebastes rastrelliger[13]等魚類卵巢發育周期內存在顯著差異，在排卵和產卵期間表達水平最高，產卵后GnRH mRNA表達量顯著降低，這與本研究中GnRH mRNA表達水平的變化趨勢相似。垂體分泌的促性腺激素為FSH與LH[2-4]。FSH在魚類性腺發育早期階段主要刺激性腺分泌性類固醇激素，而LH則能促使卵母細胞最終達到成熟，是決定魚類產卵的關鍵調控因子[14]。在自然條件下，高表達的GnRH能夠刺激垂體合成與分泌大量的FSH與LH[15]。本研究發現，雌哲羅鮭性腺發育Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期時FSH維持相對較高的表達水平，這有利于促進性腺分泌E2和T等性類固醇激素。然而，在哲羅鮭排卵前高表達的GnRH并未促使腦垂體高表達FSH與LH，這可能是由于試驗用魚是在全人工條件下飼養，雌哲羅鮭無法進行生殖洄游，腦垂體發生功能異常等原因所致。相關性分析結果顯示，垂體FSH與LH具有顯著的正相關關系，這說明它們協同調控卵巢發育，能明顯促進卵巢的分化與成熟。

卵黃蛋白原（Vtg）是所有卵生脊椎動物卵黃蛋白的前體，是雌魚類卵黃的主要成分。Vtg作為一種功能性物質促進卵母細胞的生長和分化，為卵細胞和胚胎提供發育所需的營養與能源物質[16]。目前已廣泛研究了魚類性腺發育周期內Vtg的變化。在沙塘鱧Odontobutis potamophila[17]、中華鱘 Acipenser sinensis[18]和鯰 Clarias batrachus[19]產卵前（Ⅴ期卵巢）肝臟/血清中Vtg的含量最高，以確保卵巢分化、胚胎和幼體發育的營養所需。本研究結果顯示，雌哲羅鮭在性腺發育早期，肝臟VtgmRNA表達相對較低，隨著卵巢發育至Ⅳ期中期時，Vtg mRNA表達水平則達到最高。全人工培育條件下，雌哲羅鮭卵巢發育到Ⅲ期時出現卵黃顆粒，Ⅳ期早期時逐漸增多，到Ⅳ期中-晚期卵黃顆粒體積增大并充滿卵母細胞[20]。結合本研究結果可以看出，哲羅鮭卵巢中卵黃物質的積累與卵母細胞的發育呈現同步發展的關系。肝臟中VtgmRNA的表達，促使卵黃物質迅速積累，保證營養物質向性腺轉移與積累，決定卵細胞最終的發育與成熟。可見，了解雌哲羅鮭性腺發育周期內肝臟VtgmRNA表達的變化規律將為親魚生殖階段營養供給提供重要的理論依據與參考。

E2與T由卵巢分泌，參與配子的發育、最終成熟和配子排放過程，是魚類性腺成熟的關鍵調控因子[1]。研究發現，在斜帶石斑魚Epinephelus coioides[21]、西伯利亞鱘Acipenser baeri[22]、圓斑星鰈Verasper variegatus[23]的血漿中性類固醇激素（E2與T）含量在排卵前顯著升高，排卵后迅速下降。本研究中，雌哲羅鮭在Ⅱ期卵巢時血清E2與T含量相對較低，說明親魚正處于恢復生長和營養積累的階段。Ⅳ期卵巢是卵子卵黃發生的關鍵時期，大量合成Vtg，隨后T將Vtg運輸到卵細胞內[1]，這說明E2與T參與了配子卵黃發生的調控過程[24,25]。本研究中，隨著哲羅鮭卵母細胞中卵黃發生基本完成，血清中E2與T含量降低，當親魚卵巢發育至Ⅴ期時，血清中E2與T含量明顯增加，這在一定程度上說明E2與T在親魚產卵前起正向調節性腺發育的功能。

綜上所述，GnRH、FSH與LH以協同的方式共同參與了哲羅鮭卵巢發育的過程，其調控作用與Vtg、E2與T的合成與分泌緊密相關。了解哲羅鮭卵巢發育過程中性激素因子的變化規律，將有助于系統、科學地開展哲羅鮭人工繁育與健康養殖。然而，在全人工飼養條件下，哲羅鮭性腺發育受到了諸多因素的影響，HPG軸的調控機制還需結合環境因子、人為干預等因素進行深入的探討與研究。