雙峰駝血清IgG純化及其抗血清制備

賈存瑜，韓熙夢，聶佳琪，張 欣，焦韻潔， 劉寶元，周恩民，穆 楊

(西北農林科技大學 動物醫學院/農業部獸用藥物與診斷技術陜西科學觀測實驗站，陜西楊凌 712100)

免疫球蛋白G(IgG)是機體血清中的主要抗體成分，約占血清抗體的75%，是體液免疫應答中發揮抗感染免疫的主要活性物質。駱駝血清中有3種類型的 IgG，分別為 IgG1、 IgG2 和 IgG3，其中 IgG1 為傳統抗體，IgG2 和 IgG3 為重鏈抗體(Heavy-chain only antibodies, HcAbs)，在駱駝科動物中占IgG 總量的45%～75%[1-3]。與傳統的IgG1型抗體不同，重鏈抗體是一類缺失輕鏈和重鏈第一個恒定區(CH1)的新型抗體，這種缺失輕鏈的重鏈抗體可變區(Variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies, VHH)晶體結構呈橢圓形，長 4 nm，直徑2.5 nm，分子質量約15 ku，因此又被稱為納米抗體(Nanobody, Nb)。Nb是目前已知最小的具有完整抗原結合功能的抗體片段[4-5]。相比于常規抗體的抗原結合區，納米抗體的單結構域性質具有獨特的特征，除了容易從體內成熟文庫中克隆和選擇高親和力結合物的優點外，納米抗體還具有其他技術、功能和生物物理學優勢，如高表達產率和易于純化、高度可溶且穩定、識別獨特的構象表位等。納米抗體具有較高的特異性，而且由于納米抗體結構簡單，更便于被基因工程改造、重組表達和生產等[6-7]。目前已報道獲得多種抗原的納米抗體，抗原從小分子(如半抗原和肽)到大抗原(如蛋白質或病毒)都有[8]。制備納米抗體常用的方法為噬菌體展示技術，用抗原免疫雙峰駝，收集雙峰駝血清，檢測抗體效價水平達到要求后分離免疫駱駝外周血淋巴細胞，提取細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA，經2輪PCR擴增獲得編碼VHH的基因，連接噬菌體展示載體，經電轉化等過程構建噬菌體抗體文庫；然后利用抗原反復從文庫中淘選，獲得表達針對目的抗原納米抗體的重組噬菌體，用重組噬菌體感染合適的感受態細胞，IPTG誘導表達納米抗體，進行一系列鑒定后可以采用不同的表達系統進行納米抗體的大量表達。

西北農林科技大學動物醫學院重大動物疫病病原感染和致病機制研究團隊(本團隊)前期表達純化PCV2 Cap蛋白并進行雙峰駝免疫，采集駱駝血清，為構建多樣性廣泛的Cap蛋白納米抗體文庫，需對免疫后駱駝血清中抗Cap蛋白的抗體效價進行檢測；目前已獲得針對不同病毒蛋白的多種納米抗體，后期需要對這些納米抗體進行鑒定。然而，市場上目前尚無商品化的抗駱駝IgG的抗體。本研究通過純化駱駝血清IgG，并用純化的駱駝IgG免疫家兔，制備兔抗駱駝抗血清，為免疫血清效價檢測及納米抗體檢測提供材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 成年雄性阿拉善雙峰駝購自甘肅民勤駱駝養殖場，寄養于該廠，觀察 1 周后采血制備血清；雄性家兔 2 只，購自楊凌周邊農戶，飼養于西北農林科技大學動物醫學院動物醫院，觀察 1 周后進行免疫。

1.1.2 主要試劑 Protein G 純化介質購自金斯瑞生物科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品；HRP標記的羊抗兔IgG為Jackson Immuno Research公司產品；蛋白質Marker為Thermo-Fisher公司產品；純化的PCV2 Cap蛋白、原核表達的豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)核蛋白納米抗體(SIV-Nb1)、連接穿膜肽TAT的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)Nsp9納米抗體(PRRSV-TAT-Nb6)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)N蛋白納米抗體(PEDV-Nb2)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)S蛋白納米抗體(TGEV-Nb15)由本團隊制備并保存；PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所蔡雪輝研究員饋贈，96 孔酶標板為NUNC 公司產品；其他常規試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 駱駝血清樣本制備 頸靜脈采集成年雄性阿拉善雙峰駝血液于50 mL無菌離心管，放置呈斜面，待血液凝固后將離心管置于37 ℃恒溫箱中30 min，再4 ℃放置過夜。用槍頭將血凝塊從管壁上撥落，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，收集血清分裝保存，備用。

1.2.2 駱駝血清IgG 的純化與鑒定 取5 mL血清與0.01 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖鹽液(PBS) 按體積比1∶1混勻，用0.45 μm濾膜過濾得待純化樣品。用Protein G 親和樹脂純化駱駝血清IgG，純化前先用10倍柱體積的PBS平衡柱子至流出液A280≤0.01，將10 mL待純化樣品緩慢上柱，保持流速為0.5 mL/min，重復上樣8～10次，然后用 30 mL PBS洗滌樹脂，流速控制在 1 mL/min，至流出液 A280穩定為止；用5倍柱體積的Elution buffer(0.1 mol/L pH 2.7甘氨酸溶液)洗脫IgG，流速控制在0.5 mL/min，每管收集洗脫液0.5 mL，并迅速加入50 μL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)中和pH至7.2～7.4。用超微量分光光度計測定每管洗脫液中 IgG的質量濃度，將質量濃度大于 0.5 mg/mL 的樣品合并，用 PBS 透析過夜后分裝，-20 ℃保存。留取少量樣品用 SDS-PAGE 分析蛋白純度。

1.2.3 純化的駱駝IgG純度分析 配制12%分離膠和5%濃縮膠并組裝電泳裝置，取適量收集的樣品加入2×SDS-PAGE loading buffer混勻后沸水浴10 min，10 000 r/min 離心1 min，取10 μL 加入蛋白膠孔，電壓100 V電泳約15 min后，調電壓至200 V繼續電泳，至溴酚藍電泳至凝膠下邊緣停止。小心取出凝膠，考馬斯亮藍染液染色2 h，脫色后觀察IgG 純化效果，并拍照保存。

1.2.4 兔抗駱駝IgG抗血清制備 家兔免疫前耳緣靜脈采血2 mL左右，分離血清-20 ℃保存，用作陰性對照。取純化的駱駝IgG 1 mg與等體積弗氏佐劑充分乳化，每只家兔每次免疫1 mg駱駝IgG，脊柱兩側皮下分點注射，間隔 2 周免疫 1 次，首次免疫使用弗氏完全佐劑，之后使用弗氏不完全佐劑。第 3 次免疫1 周后，頸動脈采集血液，分離血清，分裝保存。

1.2.5 兔抗駱駝IgG抗血清抗體效價檢測 采用間接 ELISA 方法檢測兔抗駱駝 IgG 抗血清的抗體效價，以免疫前家兔血清為陰性對照。將純化的駱駝 IgG 用 PBS 稀釋至4 μg/mL，取 96 孔酶標板，每孔加入100 μL，4 ℃包被過夜。PBS’T(φ=0.05% Tween-20的PBS)洗板4次后每孔加入封閉液(50 g/L 脫脂奶粉的PBS’T溶液) 200 μL，室溫封閉2 h，PBS’T洗板4次，將分離的免疫兔血清用封閉液稀釋至1∶1 000后再依次倍比稀釋加入96孔酶標板，每孔100 μL，每個稀釋度重復3孔，室溫孵育2 h，PBS’T洗板后每孔加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，每孔100 μL，室溫孵育2 h。洗板后，用TMB顯色液顯色15 min，3 mol/L H2SO4終止反應，用超微量分光光度計讀取每孔450 nm吸光度值(OD450)。以免疫血清OD450/陰性血清 OD450>2.1的最高血清稀釋倍數確定兔抗駱駝IgG抗血清的抗體效價。

1.3 抗血清的應用

1.3.1 PCV2 Cap蛋白免疫駱駝血清抗體效價檢測 用純化的Cap 蛋白免疫雙峰駝，免疫前頸靜脈采集駱駝血液，分離血清作為陰性對照。每次免疫量為2 mg，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，之后用弗氏不完全佐劑乳化；皮下分點注射免疫，每間隔2周免疫 1 次。免疫5 次后頸靜脈采集血液，分離血清，采用間接ELISA方法檢測免疫血清中抗Cap蛋白的抗體效價。將純化的Cap 蛋白用PBS稀釋至4 μg/mL，加入96 孔酶標板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜。PBS’T洗板4次后每孔加入200 μL 封閉液室溫封閉2 h，免疫前和免疫后的駱駝血清分別進行倍比稀釋后加入96 孔酶標板，每孔100 μL，每個稀釋度做3 個重復，室溫反應2 h，PBS’T洗滌4 次后每孔后加入1∶2 000 稀釋的兔抗駱駝IgG抗血清100 μL，室溫反應 2 h，PBS’T洗滌4 次后每孔加入1∶5 000 稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG 100 μL，室溫孵育2 h。洗板后，用TMB顯色液顯色15 min，3 mol/L H2SO4終止反應，用超微量分光光度計讀取每孔OD450。

1.3.2 納米抗體的Western blot檢測 將原核表達SIV-Nb1、PRRSV-TAT-Nb6、PEDV-Nb2、TGEV-Nb15和 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7進行12% 分離膠的SDS-PAGE后轉至PVDF膜，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h后，以制備的兔抗駱駝血清IgG(1∶2 000稀釋)為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)為二抗進行Western blot檢測，確定制備的抗血清與針對不同病毒蛋白的納米抗體的反應原性。

2 結果與分析

2.1 駱駝血清IgG 的純化

用Protein G 親和樹脂純化駱駝血清IgG，SDS-PAGE 檢測認為駱駝IgG純度良好(圖1)。從圖1可以看出，用Protein G純化的駱駝 IgG 中存在2種類型的重鏈，一種是傳統的分子質量約 50 ku的重鏈，另一種是缺失CH1的分子質量為 43 ku 左右的重鏈。在洗滌液中也可以隱約看到一條重鏈，是沒有和Protein G結合的IgG2型重鏈。超微量分光光度計測得純化的駱駝IgG質量濃度為1 mg/mL，共獲得12 mg 純化的駱駝IgG，完全滿足后續家兔免疫和抗體效價檢測。

M. 蛋白質分子標準 Protein marker；1.PBS；2～4. 洗脫液 Elution buffer

圖1SDS-PAGE分析駱駝IgG純化效果
Fig.1AnalysisofpurifiedcamelIgGbySDS-PAGE

2.2 兔抗駱駝IgG抗血清效價檢測

利用間接ELISA方法，對免疫后的2 只免疫兔血清進行抗體效價檢測(圖2)，從圖2可以看出，免疫前血清的OD450一直很低，隨著稀釋度的增大，OD450不斷降低，2只免疫兔血清在稀釋1 024 000倍時，OD450仍分別達0.206±0.009 9和0.264±0.030 2，與陰性對照血清OD450(0.129±0.002 1)比值均小于2.1，因此確定獲得的免疫兔血清中兔抗駱駝IgG抗體效價為1∶512 000[9]。

圖2 兔抗駱駝IgG 抗血清抗體效價檢測Fig.2 Antibody titer of rabbit anti-camel IgG immune sera

2.3 PCV2 Cap蛋白免疫駱駝血清抗Cap蛋白抗體效價檢測

用純化的Cap 蛋白免疫雙峰駝，第5次免疫1 周后采集血液分離血清，間接ELISA方法檢測免疫血清中抗Cap蛋白的抗體效價，結果如圖3所示。免疫前血清OD450小于0.115±0.004 1，免疫后血清4 000倍稀釋時OD450為1.977±0.094，隨著血清稀釋倍數的增大，OD450不斷降低；當血清被稀釋1 024 000倍時，OD450為0.220±0.018，與陰性對照血清OD450(0.092±0.006)的比值為2.378，而血清被稀釋2 048 000倍時，OD450為0.130±0.004，與陰性對照血清OD450(0.072±0.012)的比值為1.802，說明免疫5次后駱駝血清中抗Cap蛋白的抗體效價達1∶1 024 000[9]。

圖3 免疫駱駝血清中抗Cap蛋白抗體效價檢測Fig.3 Antibody titer of anti-Cap protein in serum of immune camel

2.4 納米抗體的檢測

以制備的兔抗駱駝IgG抗血清采用Western blot方法檢測本團隊制備保存的原核表達的SIV-Nb1、PRRSV-TAT-Nb6、PEDV-Nb2、TGEV-Nb15和 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7。結果顯示，制備的抗血清可以與表達的納米抗體發生特異性反應，但與來源于小鼠腹水的PCV2 Cap蛋白單克隆抗體不反應(圖4)。由于這些納米抗體的CDR3區氨基酸數目多少不一，因此顯示的印跡條帶大小稍有差異，但基本均在15 ku左右；本團隊在PRRSV Nsp9的納米抗體上連接促進其穿過細胞膜的穿膜肽TAT，所以檢測到的PRRSV-TAT-Nb6條帶比其他的納米抗體條帶稍大一些。結果說明制備的兔抗駱駝IgG抗血清可以用于納米抗體的檢測。

圖4 納米抗體的Western blot檢測Fig.4 Detection of different nanobodies with Western blot method

3 討 論

1993年，Hamers-Casterman等[2]報道在駱駝科動物(單峰駝、雙峰駝、美洲駝等)體內不僅存在分子質量約為 150 ku 的常規四聚體抗體 IgG1，還存在天然的重鏈抗體(Heavy chain antibodies，HcAbs)，包含IgG2和IgG3亞型；其中IgG1由2條重鏈和2條輕鏈構成的，而HcAbs僅由2條不含第一個恒定區(CH1)的重鏈構成。常規抗體的抗原識別位點是由重鏈和輕鏈的可變區形成，與傳統IgG的抗原結合位點相比，駱駝重鏈抗體的抗原識別位點僅由一個單獨的結構域構成，即重鏈抗體可變區(Variable domain of the heavy chain of HCAb,VHH)[10]。納米抗體較普通抗體具有一些獨特性能，如分子質量小、親和力高、穩定性高、水溶性好、免疫原性弱、抗原結合力廣泛且良好等[11]。納米抗體的尺寸很小，使其成為體內功能性干擾研究的便利工具[12]。由于其獨特的性質，納米抗體在未來的結構生物學、基因調控網絡分析和信號轉導研究中有取代常規抗體[13]的潛力。

目前，納米抗體作為一種新型小分子抗體已成為生物科技領域的研究熱點，在人醫上，納米抗體在科學研究、腫瘤等疾病檢測與治療、疫苗研發、霉菌毒素檢測等方面均取得顯著的成果[14-18]。在獸醫方面，有關納米抗體的研究也越來越多[19-21]。筆者團隊的劉紅亮博士利用噬菌體展示技術分別篩選到豬繁殖與呼吸綜合征病毒 Nsp9及Nsp4蛋白的納米抗體，并在HEK293T 細胞進行Nsp9納米抗體Nb6的穩定表達，發現胞內表達的 Nb6 可以結合PRRSV 編碼的Nsp9蛋白，并抑制病毒基因的復制和轉錄，有望開發成為新型的抗PRRSV藥物[22-23]。

常用的納米抗體制備方法為噬菌體展示技術，即以免疫駱駝淋巴細胞基因組為模板擴增表達VHH的基因片段，將序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使VHH基因隨噬菌體外殼蛋白的表達而表達，同時，VHH隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面[24]。為構建多樣性廣泛的噬菌體納米抗體文庫，駱駝免疫后需要檢測免疫駱駝血清中針對目的蛋白的抗體水平，篩選完成后也需要對表達的納米抗體進行特異性與效價檢測。然而，市場上目前尚缺少商品化的抗駱駝IgG的抗體。本研究收集駱駝血清，利用Protein G親和樹脂純化駱駝IgG，經SDS-PAGE分析，純化的駱駝 IgG 中存在2種類型的重鏈，一種是傳統的分子質量約 50 ku的重鏈，另一種是缺失CH1的 43 ku 左右的重鏈，SDS-PAGE顯示沒有約46 ku的IgG2型重鏈，因為IgG1和IgG3結合Protein G和Protein A，而IgG2只結合Protein A[2,25-26]，如果要收集IgG2，只要用Protein G的流穿液(Flow-through)再過Protein A樹脂進行純化即可。用純化的駱駝IgG 免疫家兔，分離免疫兔血清，采用間接ELISA方法檢測血清抗體效價，結果顯示兔抗駱駝IgG抗血清抗體效價超過1∶512 000，利用制備的兔抗駱駝IgG抗血清檢測PCV2 Cap蛋白免疫后駱駝的抗體水平，顯示5次免疫后駱駝血清中抗Cap蛋白的抗體效價達到1∶1 024 000以上，說明制備的兔抗駱駝IgG抗血清能用于后續納米抗體制備中的ELISA檢測。用制備的抗血清采用Western blot方法檢測本團隊制備保存的針對不同病毒蛋白的納米抗體SIV-Nb1、PRRSV-TAT-Nb6、PEDV-Nb2、TGEV-Nb15和 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7，發現制備的抗血清可以和納米抗體反應而不與來源于小鼠腹水的單克隆抗體反應，說明制備的兔抗駱駝IgG抗血清可以用于后續表達的納米抗體的檢測。本研究結果為目標蛋白免疫駱駝后抗體效價檢測提供關鍵的材料，也為表達的納米抗體的檢測提供材料。