文冠果種子蛋白質提取及組分分析

宋宏新，劉 娟，薛海燕

( 陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

文冠果(Xanthocerassorbifolia)屬無患子科、落葉灌木或小喬木，是中國北方特有的珍稀木本油料植物果實[1]。由于其花美果豐，抗旱耐寒，在美化鄉村、治理荒山和水土保持工程中意義重大，因此被大量種植。文冠果種仁蛋白質含量豐富，脂肪含量約55%～60%，多糖2%～3%，其油脂含90%以上的不飽和脂肪酸[2-4]，且含有多種中藥配方中的皂苷及活性化合物[5]，已有用于食用及輕化工產品的開發研究[6]。植物蛋白是素食者重要的蛋白來源[7-8]，營養與動物蛋白相仿，但更易于人體消化。文冠果種子壓榨油脂后剩余的種粕中富含蛋白質，其所含氨基酸種類齊全，且經動物試驗研究表明，文冠果仁中蛋白質利用率接近酪蛋白，超過經特殊加工的濃縮大豆蛋白和葵籽蛋白[3,9]。但由于文冠果種子的基礎研究資料相對缺乏，食用歷史較短，作為新資源食品暫未獲得國家許可。近年來，中國文冠果育林及產果量持續增加，對文冠果油脂的加工利用研究也相應增多，主要作為生物柴油與高級食用油進行開發[10]，也有將其葉進行加工作為涼茶的開發利用[11]，而對文冠果中的蛋白質研究較少。因此，為充分利用文冠果種子資源，實現其高附加值的加工利用，為相關產品的開發奠定基礎，對其種子蛋白質進行系統的基礎分析研究十分必要。

以大豆為代表的植物種子大多以堿溶酸沉法提取分離種子蛋白質，文冠果也有如此的提取研究，但對文冠果種子蛋白質的系統研究分析報道甚少，有關其種子蛋白質的組分及亞基種類與構成資料缺乏。本研究采用溶劑浸提法對文冠果種子中的主要蛋白組分進行提取定量及電泳定性分析，旨在為文冠果種子蛋白提取工藝的優化奠定基礎，為文冠果資源的充分開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

文冠果購于陜西文冠果實業集團有限公司(產于陜西淳化)，去除果殼后，將種子冷藏備用。

試劑：NaOH、石油醚(30～60 ℃)、乙醇、NaCl(均為分析純)；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(美國Sigma公司)；Tris-base、甘氨酸(美國Amresco公司)；SDS(普洛麥格(北京)生物技術有限公司)；N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(美國Amersham公司)；β-巰基乙醇(上海源葉生物科技有限公司)；考馬斯亮藍R-250(加拿大Bio Basic公司)。

1.2 儀 器

真空冷凍干燥機(DZF-6020 上海一恒科學儀器有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S 鞏義市予華儀器有限責任公司)；自動凱氏定氮儀(KN520 濟南阿爾瓦儀器有限公司)；石墨消解儀(SH220 濟南海能儀器股份有限公司)；水浴振蕩器(HZS-HA 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；高速冷凍離心機(HC-3018R 安徽中科中佳科學儀器有限公司)；凝膠成像分析系統(GIS400 南京馳順科技有限公司)。

1.3 文冠果種子蛋白的提取

1.3.1 文冠果種子蛋白組分的提取 采用連續分級提取法[12]提取文冠果種子蛋白組分。原料的脫脂處理：文冠果種子經人工去殼，粉碎后，采用石油醚進行脫脂處理，按料液比(1∶10)加入石油醚(沸程：30～60 ℃)，采用超聲波清洗器超聲20 min，于5 000 r/min離心5 min，重復2次，將沉淀置于通風櫥直至溶劑揮發完全，得到文冠果種子脫脂粉，4 ℃下密封冷藏。

采用4種溶劑(H2O、φ=10%NaCl、φ=75%乙醇及φ=0.2%NaOH)依次連續分級提取蛋白質，根據各蛋白組分在不同溶劑中的溶解性差異進行分級提取，分析文冠果種子蛋白組分構成。

清蛋白的提取：準確稱取脫脂粉1.50 g，放入50 mL離心管中，加入20 mLH2O，置搖床上震蕩2 h，于4 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液作為一次提取樣待測。再向沉淀中加入10 mL H2O提取，震蕩，離心，收集上清液，合并兩次上清液作為2次提取樣待測。重復第2次的步驟，合并3次上清液作為3次提取樣待測。

球蛋白的提取：向提取清蛋白后的沉淀中加入φ=10%NaCl，3次提取步驟及溶劑用量同清蛋白提取操作，分別得到球蛋白3次提取液樣待測。

向提取球蛋白后的沉淀中加入φ=75%乙醇，向提取醇溶蛋白后的沉淀中加入φ=0.2%NaOH，同上操作，分別得到醇溶蛋白和谷蛋白提取液樣待測。

1.3.2 一次直接提取法提取文冠果種子蛋白 采用一次直接提取法提取蛋白[13]：準確稱取脫脂粉1.50 g，分別采用4種溶劑(H2O、φ=10%NaCl、φ=75%乙醇及φ=0.2%NaOH)作為溶劑浸提劑，研究單一溶解對4種蛋白的一次性直接提取。提取操作程序同連續分級提取法中清蛋白的提取步驟，分別得到水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白的3個不同體積的提取液，-20 ℃下保存，備用。依據公式(1)計算蛋白提取率。

蛋白提取率=提取液中的蛋白量/總蛋白量×100%

(1)

1.3.3 堿溶酸沉法提取文冠果種子蛋白 堿溶酸沉法提取蛋白[14]：準確稱取5.00 g脫脂粉與55 mL超純水混合，用1 mol/L的NaOH溶液調節pH至11.0，在41 ℃下恒溫磁力攪拌浸提30 min，離心20 min，得到蛋白提取液，重復以上步驟，合并2次提取液(剩余殘渣冷凍干燥后待測)，用1 mol/L的HCl溶液調至pH 4.6，離心(收集上清液，待測)；加入適量超純水將沉淀溶解，再用1 mol/L的NaOH溶液調節pH至7.0，進行冷凍干燥后即得蛋白粉，稱量后低溫保存。

將提取過程中各保留樣品用凱氏定氮法測定蛋白含量，并依據公式(2)計算蛋白得率。

蛋白得率=(蛋白粉質量×蛋白粉純度)/脫脂粉質量×100%

(2)

1.4 文冠果種子蛋白的定量和定性分析

1.4.1 凱氏定氮定量分析 采用凱氏定氮儀分別對各蛋白組分提取液進行蛋白質量分數測定[15]，蛋白質轉化系數取6.25。

1.4.2 SDS-PAGE電泳定性分析 電泳樣品制備：分別量取連續分級提取出的4種蛋白組分提取液，以1∶1的體積比加入2×SDS樣品緩沖液(含巰基乙醇)，其中蛋白粉和脫脂粉樣品加入適量的樣品緩沖液調整其蛋白質量濃度至10 mg/mL，搖勻，100 ℃煮沸5 min，于3 000 r/min離心5 min，點樣[16]。

電泳條件：凝膠電泳的分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%[17]，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、蛋白粉、脫脂粉的點樣量分別為13、12、15、12、8、8 μL。

在恒定電流30 mA條件下進行電泳，考馬斯亮藍G-250進行染色，脫色液進行脫色。之后用凝膠成像儀進行圖像掃描，并分析電泳結果。

2 結果與分析

2.1 文冠果種子粗蛋白質量分數

根據凱氏定氮法測定去殼后的文冠果種子中粗蛋白質量分數為26.29%±0.05%，采用索氏抽提法測得種子中粗脂肪質量分數為57.67%±0.02%，經脫脂后測得脫脂粉中粗蛋白質量分數為62.04%±0.01%。結果顯示，文冠果種子中富含脂肪和蛋白質，脫脂粉中的蛋白質量分數高，文冠果種子目前主要開發利用脂肪，然而，脫脂后的剩余籽粕可作為優質蛋白資源進行開發。

2.2 文冠果種子蛋白定量分析

2.2.1 連續分級提取法提取文冠果種蛋白組分 以文冠果種子脫脂粉為提取原料，采用4種提取劑依次連續分級提取蛋白質，4種蛋白組分的3個不同體積提取液進行蛋白定量測定，計算脫脂粉中的各蛋白組分含量，結果如圖1所示。

圖1 連續分級提取蛋白組分質量分數Fig.1 Protein component mass fraction by sequential extraction

由圖1可知，3個提取階段中4種蛋白組分的蛋白含量均呈現出依次增加的趨勢，但在第3次的提取中蛋白增加量變少，因此確定提取次數為3次。經測定，分級提取法提取得出文冠果種子脫脂粉中各蛋白組分的質量分數由大到小依次為：球蛋白26.38%、清蛋白21.50%、谷蛋白2.49%、醇溶蛋白1.99%。通過計算得出采用溶劑分級提取法提取出的蛋白組分總量為52.36%，即提取率為84.40%，說明該方法能完整的分離出各主要蛋白組分。對各類不同溶解性蛋白的組成比例進行分析，表明文冠果種子蛋白具有較好的水溶性，為其進一步高效率的提取與加工工藝提供良好的參考依據。

2.2.2 一次直接提取法提取文冠果種子蛋白 采用4種提取劑一次性直接對脫脂粉進行提取，4種提取液得到的3個不同體積樣品的蛋白質定量，計算提取蛋白質在脫脂粉中質量分數，結果見圖2，計算提取率(提取蛋白質占總蛋白質的比率)，結果見表2。

圖2 一次直接提取蛋白質量分數Fig.2 Protein component mass fraction by direct extraction

由圖2可知，一次直接提取法提取得出文冠果種子中的堿溶蛋白含量最多，而醇溶蛋白含量最少。4種蛋白在3次提取中均呈現蛋白含量遞增的趨勢，第3次提取結果增加的趨勢平緩，因此確定提取次數為3次。經測定，一次直接提取法提取得出文冠果種子脫脂粉中各蛋白的提取量(以1.00 g 脫脂粉為提取原料計算)及提取率由大到小依次為：堿溶蛋白0.496 9 g和80.09%、鹽溶蛋白0.468 8 g和75.57%、水溶蛋白0.214 8 g和34.63%、醇溶蛋白0.045 0 g和7.26%。由此得出采用堿溶液提取蛋白的提取率最高，可提取80%以上的蛋白質。

對以上2種提取方法進行比較得出，一次直接提取法得出的鹽溶蛋白含量相較分級提取出的球蛋白質量分數高，是由于其中包含了部分水溶蛋白；而堿溶蛋白與分級提取出的谷蛋白結果相比質量分數較高，是由于堿溶液提取過程中包含了部分清蛋白與球蛋白。分級提取法能有效的將4種蛋白組分分離，為進一步辨別及定性分析各蛋白組分奠定基礎；而一次直接提取法的結果表明利用堿性溶劑提取文冠果種子蛋白更為高效，為文冠果蛋白的提取加工提供了科學依據。

2.2.3 堿溶酸沉法提取文冠果種子蛋白 以文冠果種子脫脂粉為原料，采用堿溶酸沉法提取蛋白，經真空冷凍干燥后，依據凱氏定氮法對該試驗提取過程中各部分蛋白質量分數進行定量測定，經測定得出提取液中的蛋白質量為0.521 5±0.000 6 g，依據公式(1)計算可得，采用堿溶酸沉法提取文冠果種蛋白的提取率為84.06%，較一次直接提取法中的蛋白提取率高。

通過進一步對堿溶酸沉法得到的提取殘渣、沉淀后上清液和蛋白質粉進行定量計算(表1)，該方法得到沉淀干燥蛋白粉的純度為83.92%，由公式(2)計算出蛋白得率為36.40%，其結果與孔維寶等[18]采用單因素試驗和正交試驗優化研究結果相當。

表1 堿溶酸沉法各步驟樣品蛋白質定量結果Table 1 Quantitative results of protein in each step by alkali-solution and acid-isolation extraction

通過表1計算提取過程3個樣品蛋白質總量，與實際測得總蛋白質量分數為62.04%的結果相符，該法得到了種子中58.70%的蛋白質，殘渣剩余蛋白質占比為12.90%，提取液未沉淀(上清液)蛋白質占比為28.40%。由結果可知，要提高蛋白得率，對堿液提取工藝進行優化，應在研究蛋白質特性表征基礎上，優化酸沉條件，從而達到減少損失的目的。

2.3 文冠果種子蛋白SDS-PAGE分析

對試驗中文冠果種子蛋白質5個樣品、脫脂粉及蛋白Maker的SDS-PAGE分析結果如圖3所示。

根據選用的蛋白Maker(分子質量依次為：118、90、50、34、26、19 ku)電泳后的遷移率及其分子量確定出標準曲線，再根據圖譜中蛋白遷移率計算出圖譜中各蛋白的主要亞基分子質量。并使用Image J軟件分析電泳圖譜中的蛋白條帶灰度值，計算其相對質量分數，結果見表2。

a.清蛋白 Albumin；b.球蛋白 Globulin；c.醇溶蛋白 Gliadin；d.谷蛋白 Glutenin；e.蛋白粉 Protein powder；f.脫脂粉 DefattedXanthocerasseeds；g.Maker

圖3 文冠果種子蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of Xanthoceras seeds protein

理論上種子脫脂粉包含了文冠果種子全部的蛋白質(簡稱總蛋白)，圖3的電泳圖譜顯示，該泳道(f)電泳條帶最多，可以鑒定為10個，各亞基分子質量及相對質量分數如表2所示，其亞基分子質量分布于20～60 ku，包含3個主條帶，其分子質量分別為25.76、38.05和56.76 ku。

對比4種蛋白組分與脫脂粉的電泳圖譜可得，其中清蛋白(泳道a)的條帶顯示最多，且分布廣，包含7個條帶，2條主帶的分子質量分別為25.76和38.05 ku，表明文冠果種中的蛋白質具有較好的水溶性。球蛋白(泳道b)含4個條帶，其中38.05和56.76 ku為高含量亞基。谷蛋白(泳道d)含3個條帶，兩條主帶為25.76 ku和38.05 ku。而醇溶蛋白(泳道c)由于蛋白質量分數低，條帶模糊，僅有18.74 ku明顯可見。通過比較分析可以看出相對分子質量為38.05 ku的蛋白亞基在4種提取溶劑中均呈現出較高的溶解度，表明該蛋白亞基質量分數較多；相對分子質量為25.76 ku的蛋白亞基在水溶液以及堿溶液中的溶解度較高。

堿溶酸沉得到的蛋白粉包含了文冠果種子絕大部分的蛋白質，蛋白粉(泳道e)電泳可鑒定8個條帶的亞基分子質量及相對質量分數如表2所示，其中2個主條帶的分子量分別為38.05和56.76 ku。與總蛋白進行對比可以看出，堿溶酸沉法提取出的蛋白中分子質量為25.76 ku的蛋白亞基質量分數較少，而該亞基卻顯示為谷蛋白中的一條主帶，可能是由于提取液的濃度或酸沉不充分導致。由此可得，為保證提取蛋白的完整性，應進一步優化堿溶酸沉法提取蛋白過程中的提取條件。

3 結 論

采用連續分級提取法分離得出文冠果種子脫脂粉中球蛋白及清蛋白質量分數較多，一次直接提取法得出采用堿溶液可高效提取文冠果種蛋白，堿溶酸沉法的蛋白提取率可達84.06%，并得到純度為83.92%的蛋白粉。對比直接浸提法與堿溶酸沉法的蛋白提取率，表明堿溶酸沉法提取蛋白的提取效率高，操作條件易于控制，便于工業化放大生產文冠果種蛋白粉。通過SDS-PAGE電泳對提取出的蛋白分析得出文冠果種子蛋白質包含有10種亞基，其中質量分數較大的亞基分子質量為：56.76、38.05和25.76 ku。有關文冠果種子蛋白質的營養安全與加工工藝特性還有待深入研究。然而，文冠果作為一種亟待開發的優質蛋白源，對其種子蛋白組分及溶解提取特性的研究，為實現對其高效的工業化提取蛋白，并進一步應用于食品行業提供了基礎。