龍竹微波水熱法制備低聚木糖的研究

王 毓，熊子靈，肖 霄，李居南

(1.新希望乳業股份有限公司 產品研發中心，成都 610041; 2.成都市華測檢測技術有限公司 食藥農化事業部， 成都 610041; 3.四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065； 4.蒙牛集團 研發創新部，北京 101100)

隨著人類對健康的日益重視，低聚木糖作為一種十分有潛力的益生元，目前受到廣泛關注。低聚木糖是一類以木糖為基本單元、聚合度為2～10的寡糖。目前，大量研究證明低聚木糖對人體腸道益生菌的生長有良好的促進作用[1]。

低聚木糖在天然產物中的含量很低，難以提取。而農林生物質中的半纖維素組分含有大量木聚糖，是制備低聚木糖的良好原料。目前，有大量文獻報道可采用玉米芯、蔗渣、楊木、小麥秸稈等為原料來制備低聚木糖[2-3]。而所用的方法主要有3種：酸水解法、酶水解法以及自水解法，其中自水解法因其不需要化學試劑的特性，以及水解后的物料可用做制備生物乙醇的原料的特性，有較多研究報道和應用[4]。自水解法也稱水熱處理法，它是通過水在高溫高壓下釋放出的水合氫離子來促進生物質的水解。通過控制反應溫度等條件，以達到較好的制備低聚木糖的效果。與此同時，也有相關研究報道表明，水熱法制備的低聚木糖對人體腸道益生菌的體外發酵效果較酶水解低聚木糖更好[5-6]。因此，工業上越來越多地采用水熱法來制備低聚木糖。微波處理是一種良好的促進化學反應的方法，在化學合成、降解等方面有較多應用。微波輔助法可以加速化學反應的進行，且其升溫速率遠高于傳統加熱方法，因此微波輔助水熱處理可以加速生物質的水解，制備低聚木糖[7]。

龍竹作為一種廣泛分布于中國云南地區的竹材，其產量巨大、生長迅速、成本低廉、工業利用潛力大。本研究采用微波輔助水熱法、以龍竹為原料來制備低聚木糖，通過對反應溫度進行控制以獲取最佳反應條件，并與傳統水熱法進行對比。

1 材料與方法

1.1 原 料

龍竹原料于2015年采集自云南省，經80 ℃烘干后粉碎、過篩取其中40～80目的樣品。分離后的竹粉樣品置于索氏提取器中抽提6 h (甲苯/乙醇，體積比為2∶1)。抽提后的樣品置于60 ℃烘箱中干燥6 h后，然后用80 ℃熱水抽提樣品4 h 以脫除所含淀粉。抽提結束后，樣品經過濾后于60 ℃烘箱中干燥12 h，然后儲存，備用。試驗所用甲苯、乙醇等試劑均為分析純，來自北京化工廠。

1.2 方 法

1.2.1 微波水熱處理 3.0 g竹粉與去離子水在反應釜中混合(固液質量比為1∶10)后放入微波反應器進行水熱反應。反應采用磁力攪拌，溫度分別控制在160、170、180、190和200 ℃，反應時間為45 min，升溫時間為2 min，微波加熱功率為800 W，保溫功率為400 W。反應結束后風冷以冷卻至室溫，然后對水熱處理樣品進行過濾，保留濾液。

1.2.2 水熱處理 同樣選取3.0 g竹粉以相同的固液質量比(1∶10)與去離子水在含PID溫度控制器的316 L鋼制批式反應器中混合。反應采用磁力攪拌，溫度和時間控制在與微波輔助水熱法相同的條件下來進行對比。反應結束后反應釜用自來水冷卻，處理后的樣品過濾并保留濾液。

1.2.3 糖分析 所制備的富含低聚木糖的液體經過0.22 μm針式過濾器過濾，然后采用配有AS50自動進樣器和ED50檢測器的離子色譜儀(HPAEC，ICS-3000，Dionex，美國)分析糖分。其中單糖采用Carbopac PA-20(4 mm×250 mm，Dionex，美國)色譜柱進行分析，而低聚糖則采用Carbopac PA-100(4 mm×250 mm，Dionex， 美國)色譜柱進行分析，所采用的檢測方法參照文獻[8]。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖等單糖標準品購自Sigma-Aldrich，木二糖至木六糖等5種低聚木糖標準品購自Megazyme(愛爾蘭)。本研究所分析的低聚木糖得率僅針對木二糖至木六糖這5種，其他的聚合度大于6的低聚木糖因為沒有標準品無法定量，因此不在本研究分析考察范圍[8-9]。

1.2.4 降解產物和分子量分析 水解制備的液體樣品經0.22 μm針式過濾器過濾后采用配有HPX-87H (7.8 mm×300 mm,Bio-Rad Laboratories,美國)色譜柱的高效液相色譜儀(GPC,Agilent 1200,Agilent Technologies,美國)分析檢測所含的糖降解產物，流動相為5 mmol/L H2SO4，速率為0.6 mL/min。

樣品的分子量分析通過裝備有PLaquagel-OH 50凝膠色譜柱的 (7.7×300 mm，Polymer Laboratories Ltd.，美國)的凝膠色譜儀(GPC,Agilent 1200,Agilent Technologies,美國)進行檢測，具體方法參見文獻[7]。

2 結果與分析

2.1 低聚木糖的制備

原料的具體成分參見文獻[4]，其中半纖維素(木聚糖)含量為21.6%，包含阿拉伯糖(0.8%)、半乳糖(0.2%)、甘露糖(0.1%)、葡萄糖醛酸(0.1%)、乙酰基(2.2%)和木糖(18.2%)[4]。

微波輔助法和水熱法降解龍竹粉制備低聚木糖在160、170、180、190和200 ℃下分別反應45 min，所得的低聚木糖的產率如圖1所示。從圖1不難發現，不論是微波輔助法還是傳統的水熱法，它們均在反應溫度為180 ℃時獲得最高得率，這與之前文獻報道結果相似[8,10]。此時，微波輔助法的低聚木糖得率為31.4%，而水熱法的得率為27.8%，由此可見在最佳反應條件下微波輔助法有更好的效果。這樣的結果可能是由于微波加熱的特性而導致的，其原理是極性分子在高頻電磁場作用下極性取向改變，引起分子的熱運動和分子間相互作用，將微波場的場能轉化為熱能[11]。因此微波加熱的升溫速率和加熱效果較傳統加熱方法優勢明顯，在處理生物質原料時可以深入原料內部加熱，使溫度瞬時升高，從而導致原料結構快速裂解。圖2為微波處理和水熱處理的升溫曲線，不難發現微波加熱到設定的溫度僅需2 min，而普通水熱法加熱到設定的反應溫度需要長達40 min的加熱期。同時，由于微波加熱可以深入反應物料內部加熱，因此其加熱效率更高，所以在180 ℃時其低聚木糖得率也較水熱處理法高。而且，在較低溫度如160、170 ℃時，其低聚木糖的產率也比水熱法在相同溫度下的高。與此同時，微波處理整個反應所需時間僅為47 min(升溫2 min，保溫45 min)，而水熱處理法則需要85 min(升溫40 min，保溫45 min)。因此，微波處理法制備低聚木糖的效率較傳統的水熱處理有明顯提高。而當反應溫度高于180 ℃時，微波處理所得的低聚木糖的得率下降較快，也是因為其加熱特性所導致的。表1為所制備的低聚木糖的組成成分，包含聚合度從2到6的5種低聚木糖，其中，在反應溫度較低時，高聚合度的低聚木糖較多，而隨著反應溫度的上升，木二糖的得率明顯上升，而高聚合度的低聚木糖得率顯著下降。Nakahara等[12]報道生物質自水解制備低聚木糖的降解機理：木聚糖中的側鏈首先斷裂，然后主鏈的β-木糖苷鍵發生斷裂，生成長鏈的低聚木糖。而連接在糖鏈上的乙酰基則被解離，在水中形成乙酸以促進降解，將長鏈的低聚木糖進一步降解成短鏈的低聚木糖。在本研究中的最佳反應條件180 ℃時，微波處理的木二糖至木六糖的比例為40.3%、23.4%、17.1%、12.5%和6.7%。而與之相比，水熱處理所得到的低聚木糖的組成比例有所不同，木四糖、木五糖、木六糖含量相對較高，這可能是由于加熱方式不同導致的。微波處理可以從反應物內部加熱，因而加熱效率較高，而水熱處理加熱需要由外而內傳導熱量。因此，這可能導致其加熱并不均勻，進一步導致低聚木糖在高溫下的過度降解。因此，在水熱反應為200 ℃時，所產生的低聚木糖得率很低，約為6.2%，而其中木二糖占69.4%。有研究[13-14]表明，聚合度較低的低聚木糖相較于聚合度高的低聚木糖，其益生元活性更好，因此，如何在獲得高低聚木糖得率的同時降低其聚合度，有重要意義。從不同溫度下微波處理和水熱處理制備低聚木糖的對比不難看出，微波處理較水熱處理有較大優勢，主要表現在快速、高效、和高產率。

圖1 微波輔助法和水熱法制備低聚木糖的得率Fig.1 Yields of xylo-oligosaccharides obtained by microwave-assisted and hydrothermal treatment

圖2 微波處理和水熱處理的升溫曲線Fig.2 Heating curves of microwave and hydrothermal treatment

組分Component微波處理/% Microwave-assisted treatment 160 ℃170 ℃180 ℃190 ℃200 ℃水熱處理/% Hydrothermal treatment160 ℃170 ℃180 ℃190 ℃200 ℃木二糖 Xylobiose12.221.740.354.161.810.512.632.445.269.4木三糖 Xylotriose14.827.323.420.416.911.417.418.524.614.3木四糖 Xylotetrose13.425.117.113.28.423.127.323.811.06.1木五糖 Xylopentose31.913.512.57.79.121.822.712.87.52.6木六糖 Xyloshexos27.712.46.74.63.833.220.912.511.77.6

2.2 液體中的單糖

除了低聚木糖，微波處理和水熱處理所得液體中還含有多種單糖，包括木糖、阿拉伯糖和半乳糖(圖3)，其中阿拉伯糖和半乳糖為其在反應液體中的質量濃度，而木糖則為其相對于原料中半纖維素的得率。阿拉伯糖是植物半纖維素中廣泛存在的一種五碳糖，一般以支鏈連接在半纖維素木聚糖主鏈的C-2和C-3位。在水解反應發生時，半纖維素的支鏈首先斷裂，因此，阿拉伯糖支鏈首先被降解并溶解在反應液中。從圖3-a中可發現阿拉伯糖在反應溫度較低時有較高質量濃度，2種處理所得的最高質量濃度均出現在反應溫度為170 ℃時，而此時水熱處理液體中阿拉伯糖的質量濃度較高。另一方面，當反應溫度為160 ℃，相對于低聚木糖的低得率，阿拉伯糖具有較高質量濃度，也說明它在水解反應中首先被降解。在溫度為160 ℃時微波處理中所獲得的阿拉伯糖質量濃度較高，說明微波加熱的效率較高，而隨著溫度的增加，當溫度超過170 ℃時微波反應所得的阿拉伯糖質量濃度迅速下降，也證明其加熱效率更好。相對而言，在較低溫度時水熱反應所得的阿拉伯糖質量濃度較低，而隨著溫度的不斷上升其質量濃度下降較慢，表明微波處理較水熱處理在加熱效率上具有優勢。半乳糖是竹材半纖維素中所含的另一種支鏈，其水解后的質量濃度如圖3-b所示。其中，微波處理和水熱處理都在190 ℃得到最高半乳糖質量濃度，而且水熱處理液體的半乳糖質量濃度僅在200 ℃時比微波處理液體中的半乳糖質量濃度高，這也是由微波處理的加熱特性導致的。而另一方面，半乳糖質量濃度在低溫時較低而隨著溫度升高其濃度增大，表明相對于阿拉伯糖，在水解過程中半乳糖更難被降解，半乳糖與木糖主鏈的連接鍵更強。

木糖是生物質自水解反應中得到的最主要的一種單糖，它是由于半纖維素的木糖主鏈發生降解生成低聚木糖，而后低聚木糖中的糖苷鍵進一步發生斷裂所得。因此其得率隨著反應溫度的上升而明顯增加。由圖3-c可見，水熱處理所得的低聚木糖從160 ℃時的2.7%上升到190 ℃時的17.3%，而當溫度上升至200 ℃時得率略微下降，為16.2%。而微波處理所得的木糖較少，在190 ℃時木糖得率為13.2%。水熱處理的木糖得率比微波處理高是因為水熱處理加熱需要由外而內，有熱傳導過程，因此加熱不均勻，導致一部分低聚木糖過度水解。

a.阿拉伯糖 Arabinose；b.半乳糖 Galactose；c.木糖 Xylose

2.3 反應副產物

除低聚木糖和單糖，生物質的水解反應還產生一定量的反應副產物，主要包括甲酸、乙酸、糠醛和5-羥甲基糠醛，它們在產物液體中的質量濃度如圖4所示。乙酸是微波處理和水熱處理中所獲得的最主要的一種反應副產物，它主要來源于反應過程中半纖維素中的乙酰基。在反應過程中，一部分乙酰基與木糖主鏈的連接鍵發生斷裂，在溶液中形成乙酸，乙酸又進一步在溶液中生成水合氫離子，促進半纖維素的降解。因此，原料中的乙酰基是自水解反應能夠發生的重要因素，而采用堿法提取的半纖維素，因為在提取過程中乙酰基與木聚糖主鏈的酯鍵均被斷開，因此無法進行自水解反應以制備低聚木糖。本試驗的溶液中乙酸質量濃度隨著反應溫度的上升而明顯提高，在200 ℃微波處理和水熱處理可以得到最高質量濃度的乙酸，分別為2.66 g/L和3.05 g/L (圖3-a)。同時，在所有的反應溫度下，水熱處理液體中的乙酸質量濃度均比微波處理高，表明水熱處理可以降解更多的乙酰基。而關于低聚木糖在益生元作用的研究表明，乙酰化的低聚木糖較未含任何取代基的低聚木糖其益生元活性更好，因此，如何在獲得高低聚木糖產率的同時盡可能保留其乙酰基，有利于低聚木糖在食品和保健品領域的應用[1,15-16]。與水熱處理比較，微波處理產生的乙酸少，表明有更多乙酰基保留在低聚木糖上，因此其相對于水熱處理有一定優勢。甲酸是反應后液體中的另一種有機酸，主要來源于糖的降解產物如糠醛、5-羥甲基糠醛的進一步裂解，因此在反應液體中含量較少，其質量濃度也隨著反應溫度的升高而有所提高，其中微波處理和水熱處理均在200 ℃時獲得最高的甲酸質量濃度，分別為0.31 g/L和0.37 g/L。而水熱處理質量濃度更高，也是因為其加熱不均勻所導致的。

糠醛是生物質水解反應中最主要的降解產物之一，它主要來自戊糖的降解，因此反應液體中糠醛的質量濃度隨溫度的升高而顯著上升。圖3-b中微波處理和水熱處理所得液體中糠醛的質量濃度隨著反應溫度的上升從最初的0.11 g/L和0.1 g/L 升至200 ℃時的3.34 g/L和4.17 g/L，說明當反應溫度過高時有大量的戊糖被降解，這對于低聚木糖的制備是不利的，因此要盡可能控制反應溫度以降低糠醛的產生。在反應溫度為180 ℃時，微波處理和水熱處理液體中所含的糠醛質量濃度分別為0.45 g/L和0.62 g/L，相對于此時較高的低聚木糖得率(約30%)它們的質量濃度并不高，而微波處理所得的糠醛質量濃度更低，更有利于低聚木糖未來的應用。5-羥甲基糠醛是反應中己糖的降解產物，因為生物質的自水解反應在溫度低于200 ℃時對于纖維素組分影響較小，只有少部分纖維素能被降解成葡萄糖。因此，反應液體中的5-羥甲基糠醛質量濃度比糠醛低很多，在制備低聚木糖的最佳溫度時，反應液體中的5-羥甲基糠醛質量濃度僅為0.16 g/L(微波處理)和0.15 g/L(水熱處理)。即使溫度上升至200 ℃，相對于反應液體中5-羥甲基糠醛的質量濃度也并不高。

a.甲酸和乙酸 Formic acid and acetic acid；b.糠醛和羥甲基糠醛 Furfural and HMF

3 結 論

龍竹粉與去離子水混合分別通過微波輔助法和水熱法進行處理以制備低聚木糖，在反應溫度為180 ℃時可獲得最大低聚木糖產率。在該反應溫度下，微波處理可制備得到31.4%低聚木糖，比水熱反應高，且此時液體中的單糖和副產物質量濃度也比水熱反應更低。同時，微波處理的加熱效率和所需的反應時間遠低于水熱處理，可以大大縮短制備低聚木糖所需時間，而且其加熱更加均勻，有利于控制反應，以制備更多的目標產物。因此，采用微波輔助法降解生物質制備低聚木糖有良好的前景。