VASP基因RNA干擾慢病毒表達載體的構建與鑒定

王靜 魏蕾 邱堃

[摘要] 目的 構建靶向血管擴張刺激磷蛋白（VASP）基因RNA干擾慢病毒表達載體。 方法 將前期構建的pcDNA6.2-miRVASP進行測序鑒定，篩選陽性克隆。通過Gateway技術中的BP反應及LR反應，將攜帶miRVASP的表達框克隆至慢病毒目的載體pLenti6/V5-DEST，構建靶向VASP基因的RNA干擾慢病毒表達載體pLenti6/V5-miRVASP；接著將其與慢病毒包裝混合物共轉染293FT細胞，收集病毒顆粒，侵染胃癌BGC-823細胞。 結果 慢病毒表達載體測序結果表明，構建的載體與預期完全一致。用收集的攜帶miRVASP表達框的慢病毒顆粒侵染BGC-823細胞，熒光顯微鏡下可見多量細胞表達強綠色熒光，證明包裝產生的慢病毒顆粒能侵染BGC-823細胞。 結論 成功構建了靶向VASP基因的RNA干擾慢病毒表達載體，并包裝產生慢病毒顆粒原液，成功侵染BGC-823細胞，為進一步在體內實驗中研究VASP在胃癌侵襲轉移中的作用奠定了基礎。

[關鍵詞] 血管擴張刺激磷蛋白；RNA干擾；慢病毒載體

[中圖分類號] R737 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0009-04

[Abstract] Objective To construct the lentiviral RNA interference expression vector targeting vasodilator-stimulated phosphoprotein （VASP） gene. Methods The pre-constructed pcDNA6.2-miRVASP was identified by DNA sequencing and the positive clones were screened. The miRVASP fragment was cloned into destination vector pLenti6/V5-DEST by Gateway techology， including BP and LR reaction， RNA interference lentiviral vector pLenti6/V5-miRVASP targeting VASP gene was constructed. Then the 293FT cells were co-transfected with the plasmid lentiviral expression vector pLenti6/V5-miRVASP and lentiviral packaging mix. The virus particles were collected and infected into gastric cancer BGC-823 cells. Results The constructed lentiviral expression vector pLenti6/V5-miRVASP was introduced into E.coli Stbl3 for amplification. DNA sequencing results showed that the constructed vector was exactly as expected. BGC-823 cells were infected with the collected lentiviral stocks carrying the miRVASP expression cassette. The results showed that a large number of cells could express strong green fluorescence， demonstrated that the packaged lentiviral stocks could infect BGC-823 cells. Conclusion The RNA interference lentiviral vector targeting VASP gene is successfully constructed and packaged as the lentiviral stocks to successfully infect BGC-823 cells， which lay the foundation for the further study of the role of VASP in gastric cancer metastasis in vivo.

[Key words] VASP； RNAi； Lentiviral vector

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。在我國，胃癌發病率居各類惡性腫瘤第二位[1]。盡管近年來胃癌病理遺傳學和分子機制研究取得了許多進展，但胃癌轉移仍然是癌癥相關死亡的主要原因之一。腫瘤轉移是一個多步驟的過程[2]，以間充質模式遷移的腫瘤細胞，首先形成由肌動蛋白絲（F-actin）網絡組裝驅動的細胞膜突起（偽足）；接著在原癌基因如c-Src及c-Abl激酶等分子和細胞骨架調節蛋白協調作用下，促進細胞遷移和侵襲[3]。血管擴張刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）是Ena/VASP蛋白家族成員之一[4]。其EVH2結構域介導其與球狀肌動蛋白（G-actin）及F-actin的結合。最新研究表明，VASP在人肺腺癌、胃癌、乳腺癌等實體腫瘤中蛋白表達水平上調[5-8]。VASP磷酸化能抑制結腸癌細胞侵襲性偽足形成[9]。因此，我們推測VASP表達及活性可能影響腫瘤浸潤進展。本研究利用前期構建的靶向VASP基因的RNA干擾真核表達載體pcDNA6.2-miRVASP及慢病毒目的載體[10]，應用Gateway重組技術中的BP反應和LR反應，構建靶向VASP基因的RNA干擾慢病毒表達載體，并包裝產生慢病毒顆粒，成功侵染胃癌細胞，以期為深入研究VASP的腫瘤生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

H-DMEM培養基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；左旋谷氨酰胺、LipofectamineTM2000、BP ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix、LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme、蛋白酶K、Opti-MEM培養基、pcDNA6.2-GW/EmGFP載體、pDONRTM221載體、pLenti6/V5-DEST載體、慢病毒包裝混合物（Packing Mix Lentiviral）、239FT細胞株、感受態均購自lnvitrogen公司；質粒小提試劑盒購自北京天根公司；1 kb DNA Ladder購自Fermentas公司；Eag Ⅰ購自NEB公司；質粒大提試劑盒購自Axygen公司。BGC-823胃癌細胞株購自武漢大學保藏中心。靶向VASP基因的小干擾RNA真核表達載體pcDNA6.2-miRVASP由本實驗室構建保存。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒入門載體pDONRTM221-miRVASP載體的構建 PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體攜帶有attB位點，可與攜帶有attP位點的pDONRTM221載體進行BP重組反應，構建帶有目的基因片段的入門克隆載體。首先將pcDNA6.2-miRVASP載體用Eag Ⅰ酶切。取等摩爾pcDNA6.2-miRVASP與pDONRTM221，加入BP ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix，25℃孵育16 h，生成入門克隆pDONRTM221-miRVASP，轉化感受態，涂布于LB平板，37℃培養12～16 h，挑取單菌落，置于LB培養基中擴增，抽提質粒。

1.2.2 慢病毒表達載體pLenti6/V5-miRVASP的構建 在LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix作用下，攜帶有attL位點的入門克隆pDONRTM221-miRVASP和目的載體pLenti6/V5-DEST發生重組反應，生成慢病毒表達載體pLenti6/V5-miRVASP。首先取等摩爾的pDONRTM 221-miRVASP和pLenti6/V5-DEST載體，加入LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix，25℃孵育16 h，轉化感受態，涂布于LB平板，培養12～16 h，挑取單菌落，于LB培養基中擴增，抽提質粒，并進行PCR鑒定，將PCR產物送測序。

1.2.3 慢病毒表達顆粒的包裝與收集 培養293FT細胞。取9 μg慢病毒包裝混合物和3 μg慢病毒表達載體質粒加入Opti-MEM培養基中。取36 μL LipofectamineTM2000加入Opti-MEM培養基中，室溫靜置5 min。將含質粒和脂質體的培養液混和，室溫孵育20 min。接著加入293FT細胞，培養48～72 h，收集含病毒的細胞培養上清液，過濾分裝，-80℃儲存備用。

1.2.4 慢病毒表達顆粒侵染胃癌細胞株BGC-823 培養BGC-823細胞，用收集的攜帶miRVASP DNA表達片段的慢病毒顆粒侵染BGC-823細胞。觀察細胞形態及EmGFP表達。

2 結果

2.1 靶向VASP基因的RNA干擾真核表達載體pcDNA6.2-miRVASP的鑒定

將重組質粒進行PCR鑒定及測序。測序結果表明，pcDNA6.2-miRVASP包含設計的SR33-2的DNA片段。

2.2 慢病毒入門載體pDONRTM221-miRVASP的構建

利用BP反應，成功構建攜帶miRVASP DNA表達片段的入門載體。質粒凝膠電泳圖。見圖1。

2.3 慢病毒表達載體pLenti6/V5-miRVASP的構建與鑒定

通過LR反應，將入門克隆pDONRTM221-miRVASP與目的載體pLenti6/V5-DEST進行重組，得到慢病毒表達載體pLenti6/V5-miRVASP。質粒凝膠電泳圖，見圖2。pLenti6/V5-DEST 質粒全長8688 bp，被置換的堿基片段長1704 bp，插入含miRVASP DNA表達片段約64 bp+936 bp=1000 bp。因此重組質粒長約7984 bp。將重組質粒PCR產物進行測序，證實表達載體成功構建。

2.4 慢病毒表達顆粒的包裝

將慢病毒表達載體pLenti6/V5-miRVASP與慢病毒包裝混合物共轉染293FT細胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察。分別可見較多量細胞表達強綠色熒光，見圖3。證實質粒轉染入293FT細胞，細胞部分融合，可見多核復合體出現，細胞內可見多量病毒顆粒。

2.5 慢病毒能侵染胃癌細胞株BGC-823

將收集的攜帶miRVASP DNA表達片段的慢病毒顆粒侵染BGC-823胃癌細胞。24 h及48 h后，熒光顯微鏡下觀察。鏡下分別可見較多量的BGC-823細胞表達強綠色熒光，見圖4。證實包裝產生的慢病毒顆粒能侵染BGC-823細胞。

3 討論

肌動蛋白細胞骨架介導了許多細胞生命活動，包括細胞黏附、細胞運動和細胞形態改變。肌動蛋白細胞骨架的功能失調與腫瘤的發生與轉移密切相關。如肌動蛋白結合蛋白（actin binding proteins，ABPs）在腫瘤中的表達失調[11-12]。VASP是一種涉及細胞膜突起動力學的肌動蛋白結合蛋白[13]。VASP主要位于層狀偽足前導端、絲狀偽足頂端和黏附斑。在細胞遷移的層狀偽足前導端，VASP作為腳手架蛋白將伸長的F-actin與ABPs結合，調節由肌動蛋白聚合驅動的偽足形成和穩定。在絲狀偽足頂端，VASP在F-actin倒刺末端施加抗蓋帽力，促進絲狀偽足形成和伸長。VASP通過重排細胞骨架，并促進F-actin伸長和成束，成為啟動和維持偽足區域的關鍵抗蓋帽蛋白[14-15]。因此，VASP在重要的生理和病理過程中發揮重要作用，包括損傷修復、神經元發育等生理過程，以及炎癥、腫瘤浸潤轉移等病理過程。

VASP與腫瘤細胞運動性密切相關。將NIH3T3成纖維細胞中VASP敲除和過表達均能誘導細胞致瘤性轉化[16-17]。VASP在肺腺癌中過表達與腫瘤分期相關[5]。VASP沉默后，下調β-連環蛋白表達，影響乳腺癌細胞侵襲[6]。VASP磷酸化在腫瘤侵襲中也發揮關鍵作用[9，18-19]，其機制可能涉及基因的表達調控[20]。不同的研究結果顯示，VASP與腫瘤瘤變和轉移有關，但其分子機制尚未闡明。我們在前期研究中，發現VASP與胃癌細胞遷移和侵襲相關[10]。

慢病毒載體法有著其他轉基因技術不可比擬的優勢。本研究將慢病毒載體包裝、包膜和目的載體三部分質粒共轉染293FT細胞，獲得慢病毒原液。Gateway技術以λ噬菌體位點特異重組反應為基礎，平移目的序列到目的載體。本研究選取了攜帶有attB位點的pcDNA6.2-GW/EmGFP載體，與攜帶有attP位點pDONRTM221載體進行BP反應，構建帶有目的基因的入門克隆。然后，將入門克隆與目的載體進行LR反應，構建了攜帶靶向VASP基因的RNA干擾表達框miRVASP的慢病毒表達載體。接著，分別將慢病毒表達載體與包裝混合物共轉染239FT細胞，收集細胞上清液，濃縮后，即得到了高滴度、無復制能力和具有良好生物安全性的病毒原液。本實驗為進一步對胃癌細胞進行高效侵染，在體內實驗中研究VASP在胃癌轉移中的作用奠定了基礎。

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（收稿日期：2018-03-23 本文編輯：任 念）