自體富血小板血漿混合磷酸鈣骨水泥修復椎體骨缺損的實驗研究

郭瑛 賈連順 吳維敏

[摘要] 目的 觀察自體富血小板血漿（PRP）與磷酸鈣骨水泥（CPC）混合物修復椎體骨缺損的效果。 方法 選取山羊18只，在每只羊L1～L6椎體側方制備6 mm×10 mm圓柱形骨缺損。根據填充方法的不同將實驗分為三組：實驗組填充自體PRP復合CPC，對照組填充CPC，假手術組不填充。于術后1、3、6個月隨機處死6只，通過影像學觀察骨愈合情況。 結果 所有動物均順利完成手術并存活。PRP中血小板數量約為全血中血小板量的5倍余，PRP中生長因子[血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子β（TGF-β）、血管內皮生長因子（VEGF）]的含量明顯高于全血中生長因子含量（P < 0.05）。在術后各時間節點，實驗組與對照組均有新生骨形成及骨水泥吸收，但實驗組更明顯，而假手術組空洞未見明顯骨修復。 結論 PRP能釋放大量的生長因子，與CPC混合后表現出很好的骨誘導和成骨性能。兩者混合物用于椎體骨缺損時效果確切。

[關鍵詞] 磷酸鈣；富血小板血漿；椎體骨缺損；動物模型；羊

[中圖分類號] R683.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0013-05

[Abstract] Objective To observe the effect of the mixture of autologous platelet-rich plasma （PRP） and calcium phosphate cement （CPC） in repairing vertebral bone defect. Methods 18 goats were included in this experiment. A 6 mm×10 mm cylindrical bone defect was prepared on the side of lumbar vertebral body（L1-L6） of each sheep. The experiment was divided into three groups according to different filling methods： the experimental group was filled by CPC in combination with PRP， the control group was filled with CPC， and the sham operation group was not filled. 6 goats were randomly executed after surgery for 1， 3， 6 months， then the bone healing conditons were observed by imaging examination. Results All animals successfully completed surgery and survived. The platelet count in PRP was about 5 times more than that in whole blood， and the contents of growth factors [platelet derived growth factor （PDGF）， transforming growth factor-β （TGF-β）， vascular endothelial growth factor （VEGF）] in PRP were significantly higher than those in the whole blood （P < 0.05）. In all time points after surgery， new bone formation and cement absorption could be observed in both experimental group and control group， but the experimental group was more obvious， while no significant bone repair sign could be seen in sham operation group. Conclusion PRP can release a large number of growth factors， and show great properties of osteoinductive and osteogenesis when combined with CPC. The composite is effective for the treatment of vertebral bone defect.

[Key words] Calcium phosphate； Platelet-rich plasma； Vertebral bone defect； Animal model； Goat

椎體骨缺損是臨床常見的問題之一。自體骨、異體骨、生物材料等多種材料可供臨床應用，但均有相應的優點與不足。隨著微創技術的發展，特別是經皮椎弓根螺釘固定以及經皮椎體成形術、椎體后突成形術的發展，可注射性骨水泥逐漸為臨床廣泛使用。最常見的骨水泥材料為聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA），但其在固化過程中產生的熱量易損傷鄰近組織，增加鄰近椎體骨折的風險，沒有骨長入及骨誘導功能，并存在潛在毒性及過敏反應等，逐漸被認識到其并非骨填充的最佳生物材料。磷酸鈣骨水泥（CPC）因其良好的生物相容性和骨傳導性而逐漸應用于臨床，但其作為骨組織工程應用的支架材料強度不足。而本研究試將富含各種生長因子的自體富血小板血漿（PRP）混合磷酸鈣用于修復椎體骨缺損，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究經過解放軍第一八七中心醫院實驗動物研究倫理委員會批準（批號院字第2016003）。海南本地山羊18只，月齡22～25個月，平均（23.67±1.28）個月，體重19～27 kg，平均（21.56±2.56）kg，雌雄不限，納入前均未施行過麻醉或因病行其他藥物治療，且排除傳染性疾病。術前常規行腰椎正側DR及CT檢查，排除病理性骨折及其他骨質異常情況。室內圈養15 d適應觀察，發現體重穩定，進食、飲水及日常活動等指標無異常，未沾染疾病后準備施術，術前禁食36 h，禁飲6 h。所有動物均購自海南大學動物科學系動物養殖中心[動物編號SYXK（瓊）-20140017]。

1.2 PRP制作及與CPC復合

制備全程嚴格無菌。造模前用兩支預先裝有1 mL復方枸櫞酸鈉抗凝劑的10 mL注射器，分別從羊股靜脈抽取5 mL血液，一管用自動化血液檢測儀進行血小板計數，另一管用作PRP制備，步驟如下：搖勻，置入離心管中，離心（2400 r/min）10 min，離心半徑為15 cm，重力加速度為1500 g。液體分為上清液和紅細胞兩層，吸取全部上清液及交界面以下1～2 mm的紅細胞至另一離心管，再次離心（以3600 r/min）15 min，棄上清液上3/4，剩余液體約0.8 mL，搖勻，即為PRP。依次吸入0.8 mL PRP、0.2 mL凝血劑（由1 mL 10%氯化鈣與1000 U凝血酶混合而成）和少許空氣，搖勻，6～10 s后，PRP凝成膠狀物（圖1）。用血紅蛋白吸管吸取PRP 10 μL，用血小板稀釋液稀釋至2 mL后行血小板計數，余PRP與CPC按質量比1∶10，按一定的液固比加去離子水調成骨水泥膏體。

1.3 模型制作及實驗分組

動物全身麻醉后取側臥位，經腹膜后入路到過腰椎體側方，用骨科專用高速鉆頭在每只羊L1～L6椎體側方垂直矢狀位各制備一個6 mm×10 mm圓柱形骨缺損，按照隨機數字表法隨機選取4個骨缺損進行材料填充，2個假手術未行材料填充。根據填充方法的不同將實驗分為三組：實驗組填充自體PRP復合CPC，對照組填充CPC，假手術組不填充。

1.4 觀察指標

分別測定全血及PRP中的血小板數量，通過酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法測定PRP中生長因子[血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子β（TGF-β）、血管內皮生長因子（VEGF）]的水平。實驗動物術后分別存活1、3、6個月后處死，取各椎體標本大體觀察，并行相關檢查觀察各組骨生長愈合情況。

1.5 統計學方法

應用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，采用非參數Mann-Whitney U或者t檢驗比較兩組間數據，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體情況及血液分析

所有動物均順利完成手術并存活。各時間節點每組分別有12個椎體可供結果分析。羊全血中血小板計數值為（224.8±32.9）×103/μL（168×103/μL～274×103/μL），PRP中血小板計數值為（1312.2±108.3）×103/μL（1150×103/μL～1527×103/μL）。PRP中血小板數量約為全血中血小板量的5倍余[484%～717%，平均（588.8±62.8）%]。PRP中生長因子的含量明顯高于全血中生長因子含量，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 骨缺損的修復

通過影像學觀察，術后CT觀察假手術組可見一個標準圓形低密度影，而實驗組與對照組可見填充物的高密度影像，1個月后骨缺損高密度區域的邊緣開始變得模糊，而假手術組仍然清晰。術后3個月，假手術組及對照組可見缺損邊緣皮質有少許骨痂形成，但空洞內部仍無明顯骨質生長，對照組空洞內填充物致密影仍清晰，實驗組空洞內填充物邊緣逐漸模糊，骨水泥有吸收。術后6個月，假手術組與對照組缺損邊緣皮質形成骨性連接，形成“蓋”，但假手術組內部空洞及對照組內骨水泥致密影仍無明顯變化，而實驗組空洞內骨水泥密度較前降低，邊緣模糊帶更清晰，范圍更大，且部分密度與周邊骨質密度相同，提示部分骨缺損已修復完成（圖2）。

3 討論

椎體骨缺損是脊柱外科醫生臨床常見問題之一。造成椎體骨缺損的原因有很多種，最常見于椎體骨折，特別是老年骨質疏松性骨折，通過外科手段恢復椎體高度實際上僅椎體外層骨皮質復位，而被壓縮之骨小梁結構未能恢復正常解剖結構而留下空洞，也見于青壯年嚴重壓縮或者爆裂、椎體高度丟失明顯的骨折修復后的空腔。另外還包括脊柱腫瘤或者脊柱結核、感染等疾病行病灶清除后形成的骨質缺損。骨組織在損傷或丟失后有一定的再生能力，以恢復正常的構造和質地。但當骨缺損達到臨界大小時，常不能通過正常骨再生過程愈合，絕大部分缺損被致密的纖維連接組織填充[1]。當缺損嚴重影響椎體強度及脊柱穩定時，需要對椎體進行填充修復。為避免此種情況發生，常需進行骨移植。自體骨因其具有骨形成（osteogenetic）、骨誘導（osteoinductive）、骨傳導（osteoconductive）等性質而被公認為是金標準的骨移植材料。同時自體骨不會傳播疾病，并且在其逐步吸收為新形成的骨組織替代過程不會引起免疫反應。但其缺點，如供骨量較少，取骨處相關并發癥（如術區疼痛、血腫、感染，破壞正常解剖結構及致畸，以及增加醫療成本等）的發生限制了其應用。因此，各種生物或合成移植材料，各類促進骨再生的因子如生長因子、骨形成蛋白（morphogenetic proteins）、生物活性多肽、骨組織工程技術和多能干細胞（pluripotent stem cells）在過去幾十年得到應用。異體移植物是合成的有骨傳導性的骨替代物，其具有生物相容性好、供應充足、無免疫反應等優點。生物材料必須具有多孔隙的基質作用，能促進目標細胞的生長及成骨分化，從而有利于骨組織在其內部和周邊生長[2]。在此過程中，生物材料中必須有能起細胞黏附作用的成分，并且必須具備合適穩定的環境以利于骨細胞的生長與分化，如缺乏相關特質，則必須與有類似功能的物質混合。CPC是近幾年被廣泛應用于臨床的生物相容性高的材料，其主要成分為羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA），與骨中主要無機礦物質成分相同，因此較其他的生物材料（如氧化鋯、氧化鋁等）具有更好的骨傳導性，同時其發生反應后早期形成流體，具有可注射性。隨即可形成膏狀物，可以塑性成不同的形狀，以利于對不同形狀的骨缺損進行填充。同時其微觀下凹凸不平的表面利于各種生長因子的黏附及新骨形成。通過對PRP與CPC進行混合后的活體研究顯示，其新骨的形成速度比單純使用CPC高8%～10%[3]。但是，CPC仍然有一些缺點，比如其變硬后脆性增高，并且其可吸收性并不高，即使要明顯高于PMMA。本實驗研究發現，單純CPC填充骨缺損后，6個內吸收程度并不高，同時在吸收的部位，骨形成并不多。當PRP加入CPC后，6個月內雖未見骨水泥完全吸收，但是大部分被吸收的骨水泥被新生骨組織爬行替代，兩種材料復合顯示了良好的成骨性能。

PRP是一種來源方便、成本低廉和創傷較小的，能提供大量自體生長因子和細胞因子的血液制品。諸多生長因子，像PDGF、TGF-β、血小板衍化內皮細胞生長因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PDEGF）、血小板源性血管形成因子（platelet-derived angiogenesis factor，PDAF）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、血小板因子4（platelet factor 4，PF-4）等，與細胞因子（cytokines）均由血小板α-顆粒分泌，能激發促進組織修復，同時能調節這些生物活性成分的蛋白同化及分解代謝功功能之間的動態平衡，以最優方式利用這些活性成分促進組織修復[4]。同時有研究發現生長因子在合適的支架中可以影響骨細胞的趨化、分化、增殖和合適，并且調節骨的重建與重塑[5]。目前臨床及基礎研究亟待解決的是，如何獲得血小板中充足有效的活性成分，這也是導致PRP應用研究效果不一的重要原因。目前尚無PRP統一的制備標準，制備方法及工藝上的差異使產生的細胞種類和數量不同，最后導致生長因子和細胞因子的成分與含量、釋放時間不同而影響最終實驗或研究結果。目前PRP制備實驗時主要分為一步離心法與兩步離心法，臨床主要是使用各個廠家提供的成熟設備。不管采用哪種方法與設備，保證最后PRP有充足的生長因子儲備是最重要的條件。目前關于PRP起效時所需血小板含量尚無統一結論。Marx[6]認為在臨床應用中，只有最終形成的5 mL體積的PRP中血小板計數達到1000×103/μL時才有治療作用。但文中作者并未給出相關文獻依據或臨床證據。Graziani等[7]則認為當PRP中血小板含量比全血中血小板多2.5倍時，便能對成骨細胞及成纖維細胞產生積極影響。在現有能夠證實PRP釋放大量生長因子、促進成骨細胞分化的文獻報道中，Mazzocca等[8]利用市售的3種不同商用PRP制備器械制備健康人血PRP，血小板計數分別為（378.3±58.64）×103/μL、（447.7±183.7）×103/μL、（873.8±207.82）×103/μL，三種PRP均能促進7種生長因子生長，但數值最高組的明顯高于其他兩組，而低值的兩組則沒有差異。Bi等[9]發現羊血PRP中血小板數量為（1205±118）×103/μL，較全血高5倍余，能顯著促進PDGF-BB、TGF-β1、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、VEGF等四種因子釋放。本研究與其最為接近，最終提示PRP通過CPC為支架促進生長因子的釋放，誘導成骨細胞增殖分化，促進骨缺損內新骨形成。

在決定PRP最終治療作用的因素當中，PRP制備時血小板的激活是使其產生效果的措施中關鍵的一環[10]。血小板的激活分為兩步，血小板脫顆粒化使生長因子從α-顆粒中釋放；接著纖維蛋白原發生分裂構建支架，這個凝固過程促進了血小板凝膠的形成，并且限制活性成分向指定區域趨化。血小板激活方式不但影響PRP凝固，而且不同的血小板激活方式導致血小板源性生長因子釋放數量和釋放動力的不同。目前用于血小板激活的引物主要有四種：氯化鈣（CaCl2）、血凝酶及兩者的結合物，以及Ⅰ型膠原。Cavallo等[11]通過采用健康人血對上述四種方式進行對照研究發現，使用Ⅰ型膠原激活時，TGF-β1、PDGF-AB和VEGF等三種因子的數量明顯下降，而其余三種方式并無明顯差異。同時使用Ⅰ型膠原后PRP沒有凝固，而其他三種方式均在15 min內發生凝固，并且維持至24 h。Fufa等[12]雖然在實驗中發現使用Ⅰ型膠原同樣能形成PRP凝膠，與Cavallo等[11]研究結果相反，但在生長因子釋放動力學觀察中發現除了VEGF早期與長期釋放兩者無明顯差異外，使用CaCl2和血凝酶混合物為血小板激活物時，TGF-β1和PDGF-AB在12 h內釋放更顯著，即使10 d內兩者無明顯差異。但考慮到生長因子的半衰期很短，只有幾分鐘到數小時，如果它們在PRP制備后不能立即從血小板釋放出來，將會被其他組織降解。而生長因子的快速衰退，也將導致其無法很好地與去礦物質化的骨基質有效連結。因此本研究在制備羊血PRP中使用CaCl2和血凝酶的混合物作為血小板激活物，結果在30 min左右PRP凝固成膠體。

除了PRP的激活外，PRP的來源與制備后的療效有關。本實驗選取大型動物山羊為實驗動物，避免了采用鼠、兔等小型動物實驗時，由于小型動物自身血容量不足，往往難以足量采血制備自體PRP，需要使用同種異體血制備。而同種異體源性血液難以保證血小板的活性，更難以確保其能分泌生長因子。即使用同種異體源性血液能制備良好的PRP，實驗動物體內所產生的抗小板抗體也將會降低PRP的活性。同時，PRP與CPC復合的比例也是影響最后結果的重要因素。一般情況下，可溶性高意味著更高的生物活性和更好的骨傳導性能，但同時可溶性高的材料其穩定性較差，當骨傳導還未發生時就會發生嚴重的降解，從而影響最終的實際效果。Chen等[13]通過體外實驗發現，當PRP與CPC粉末按重量百分率（PRP的質量/PRP的質量+CPC的質量，wt%）為10%時，對PRP及CPC的彈性模量均有作用。9周后10wt%的PRP與CPC復合后相較于單純使用CPC在骨組織再生方面的活性更高。本研究采用其制備方法對PRP與CPC進行混合，通過影像學發現術后6個月內，PRP復合CPC能較單純使用CPC更好地誘導骨質生長，且吸收的骨水泥更好地被新生骨替代。

綜上所述，通過二次離心法能獲得高血小板含量的自體PRP。而其被CaCl2和血凝酶激活后，能釋放大量的生長因子，當將其按10wt%與磷酸鈣化骨水泥混合后，能發揮各自的優勢，最終表現出很好的骨誘導和成骨性能。兩者復合物用于椎體骨缺損時效果確切。

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（收稿日期：2017-11-20 本文編輯：張瑜杰）