基于酶底物法對菌落總數不確定度的評估分析

趙 鑫

(遼寧省鞍山水文局，遼寧 鞍山 114001)

在我國東北地區，尤其是偏遠的農村，地下水仍然是居民的主要飲用水來源。在對飲用水水質進行衛生學及污染程度評價時，菌落總數是重要指標之一。目前，菌落總數的測定方法主要采用平皿計數法[1]、測試片法[2]、多管發酵法等。上述方法所用設備簡單，但操作過程比較繁瑣，不適用于應急檢測。酶底物法則操作簡便、結果判讀快速準確、1mL水樣無需稀釋即可檢測出738個菌落總數。

測量結果質量的評定需要引入不確定度參數，任何檢測措施都存在一定的不確定度，因而此參數是實驗室質量管理體系的重要組成部分[3]，是提供準確測量結果的保障。水質微生物指標是實驗室質量控制的組成部分之一，目前大部分不確定度評定多用在理化實驗中，而微生物由于其特殊性，此方面研究較少，本文針對海城地下水具體實例，進行菌落總數不確定度評定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

PYL- 45電熱恒溫培養箱，1、10mL移液槍，366nm紫外燈、Simplate 84孔分配盤、培養基均由美國IDEXX公司提供。實驗用水為電阻率18.25MΩ·cm的超純水。

1.2 原理與方法

酶底物法所用的培養基中含有多種不同的酶物質，每一種酶的設計都有相應的細菌與之對應。細菌的特異性代謝產物會與培養基中的酶反應產生熒光信號，可用366nm紫外燈觀察。

用100mL超純水溶解固體培養基，搖勻后使用，取1mL水樣和9mL淡黃色液體培養基于分配盤中央，蓋好蓋子，在桌面上水平移動使混合液平均分配到每個孔中。將分配盤傾斜45°使多余溶液被海綿條吸收，分配盤在35±5℃下倒置培養48h。取出分配盤打開蓋子放置于13cm高處的紫外線燈下，數出顯熒光的孔格(海綿條不計入內)，對照專用MPN表得出菌落總數，如圖1所示。

圖1 酶底物法檢測菌落總數方法

1.3 不確定度來源

不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯系的參數[4]。不確定度的來源有很多[5]，在微生物檢測中主要來源于實驗室環境變化，實驗人員操作差異，培養溫度、時間、培養基批次的不同，以及樣品保存的方法和條件的不同等。

1.4 數學模型及方法

A=x

(1)

式中，A—菌落總數，CFU/mL；x—實驗檢測結果，CFU/mL。

由于細菌分布不均勻導致檢測結果分散，對菌落總數取對數后可使數據接近正態分布，再選取貝塞爾法評定其不確定度。

2 結果與討論

2.1 合成標準不確定度

以海城地下水為例，由同一名檢測員按照酶底物法，在同樣的實驗條件下，重復實驗15次，得到菌落總數測試結果，見表1。

表1 海城地下水菌落總數結果 單位：CFU/mL

根據貝塞爾公式，首先計算每組實驗數據的合并樣本標準偏差：

(2)

則合成標準不確定度：

(3)

2.2 擴展不確定度

本次實驗中，自由度v=15，選取95%置信水平，查t分布表得包含因子k95(15)=2.13，則擴展不確定度U95=2.13×0.015=0.032，即lgx=2.4984±0.032=2.4664～2.5304。取反對數，得海城地下水菌落總數取值區間為293～339CFU/mL。

3 結論

酶底物法檢測菌落總數時，是按照MPN表讀取孔格數對應的菌落總數值，得到的檢測結果有時會相差較大，所以對實驗結果取對數通過合并樣本標準偏差的方法來評估不確定度更加準確。

分析實驗結果，可以看出微生物檢測時數據結果分散性較大，以A類不確定度為主導，其他因素可忽略不計，評估菌落總數不確定度時可只做重復性分量。增加實驗次數時，可以將結果隨時加到合并樣本中，即可獲取新的取值范圍。