土壤生態系統硝化微生物研究進展

楊 賽,朱 琳,魏 巍*

(1.江蘇大學農業裝備工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013)

1 經典自養硝化(兩步自養硝化)微生物

1.1 經典自養硝化(兩步自養硝化)作用概念

經典自養硝化(兩步自養硝化)作用是指自養微生物利用CO2為主要或者唯一碳源進行的硝化作用。經典自養硝化作用過程中，微生物先將氨氧化為亞硝酸鹽,然后亞硝酸鹽再被氧化為硝酸鹽，分兩步完成[13]。土壤生態系統中常見的進行經典自養硝化的微生物如表1所示，主要分布在古細菌的奇古菌門以及細菌的硝化螺旋菌門和變形菌門。

表1 土壤生態系統中常見的經典自養硝化微生物

注：表中未填寫部分代表該種微生物還未進行分類;加☆的是不可純培養的微生物。

1.2 經典自養硝化(兩步自養硝化)微生物酶及其編碼基因

經典自養硝化(兩步自養硝化)作用包括氨氧化和亞硝酸氧化兩個階段[12]。作為該作用的限速步驟，氨氧化階段主要分為兩個過程，氨先被氧化為羥胺(NH2OH)，然后羥胺被氧化為亞硝酸，調控兩個過程的關鍵酶分別為氨單加氧酶(ammonia monooxygenase,Amo)和羥胺氧化還原酶(hydroxylamine oxidase,Hao)[14]。Amo是一個三聚體膜結合蛋白[14]，該蛋白是由分別被amoA、amoB、amoC所編碼的α、β、γ 3個亞基所組成，其中amoA基因是編碼氨單加氧酶多肽活性位點的基因[15]；Hao是一種結構排列復雜由3個亞基組成蛋白，每個亞單位由8個共價結合的血紅素組成，其中有7個C型血紅素和1個P460血紅素，P460被認為是該酶的活性中心[15]。亞硝酸氧化階段是由亞硝酸鹽氧化還原酶(nitrite oxidoreductase,Nxr)催化完成的單步過程[16]。Nxr為多亞基的膜聯復合體，基本結構為可以催化硝酸鹽和亞硝酸鹽相互轉化的α亞基以及具有電子傳遞功能的β亞基和γ亞基，除以上3個常見亞基外，一些微生物，如Nitrobacterhamburgensis的Nxr包含雙血紅素C亞基，但該亞基的作用尚未可知[16]。該3種經典自養硝化過程中關鍵酶的編碼基因中，amoA作為靶功能基因序列廣泛地應用于該自養硝化作用過程中AOA和AOB類群的分子生態學研究中。

1.3 經典自養硝化(兩步自養硝化)微生物生態多樣性

經典自養硝化(兩步自養硝化)微生物廣泛分布于陸地土壤、沉積物、水體等生態環境中[29]。按照自養硝化的步驟，其可分為以下兩類：1．氨氧化菌包括氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)。在第九版伯杰氏系統細菌學手冊中，AOB被分為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)[30]；AOA是獨立于AOB進化支之外的類群，到目前為止可培養的AOA僅有NitrososphaeraviennensisEN76[18]和NitrosopumilusmaritimusSCM1[6]兩株，不可純培養的富集物卻有不少[19-23]。羅劍飛等[29]認為，目前所有已知的AOA都屬于奇古菌門(Thaumarchaeota)，自此將NitrosopumilusmaritimusSCM1、Cenarchaeumsymbiosum和CandidatusNitrosoarchaeumlimnia等納入Group Ⅰ.1a(海洋組)，將NitrososphaeraviennensisEN76和CandidatusNitrososphaeragargensis等納入Group Ⅰ.1b(土組)，將CandidatusNitrosocaldusyellowstonii等納入Group Ⅲ，由于CandidatusNitrosotaleadevanaterra的16S rRNA基因和amoA基因序列與Group Ⅰ.1a的同源性大于Group Ⅰ.1b，但與已知的Group Ⅰ.1a的序列比較又形成獨立的分支，因此其被納入Group Ⅰ.1a-associated。2．亞硝酸鹽氧化細菌(NOB)包括硝化刺菌屬(Nitrospina)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、硝化螺菌屬(Nitrospira)[31]。其中，氨氧化菌(AOA和AOB)更多作為自養硝化作用的指示菌株進行各種土壤生態系統中相關生態學特征研究。

高利海等[32]對養蝦池底泥中的氨氧化菌群落多樣性進行研究，構建了AOA和AOB的amoA基因克隆文庫，利用末端限制性酶切技術將克隆文庫中的陽性克隆子歸類分成若干個可操作分類單元(Operational Taxa Units,OTUs)，分析后發現AOB的amoA基因克隆文庫(包括13個OUTs)中的序列屬于變形桿菌門β亞綱(β-Proteobacteria)中的亞硝化單細胞菌屬(Nitrosomonas)及Nitrosomonas-like,AOA的amoA基因克隆文庫(包括9個OUTs)中的序列幾乎都屬于泉古菌門(Crenarchaeote)，AOA的群落結構單一且存在一個優勢類群OUT3(克隆子數目占克隆文庫的57.45%)，由此發現在該環境中氨氧化細菌多樣性大于氨氧化古菌。袁飛等[33]以我國3種不同地區的土壤為研究對象，使用PCR-DGGE技術對土壤氨氧化菌區系進行分析，發現紅壤包括4個氨氧化菌種屬，潮土包括5個氨氧化菌種屬，黃泥土包括4個氨氧化菌種屬，分析發現3種土壤的氨氧化菌群存在顯著差異，紅壤與潮土、黃泥土的氨氧化菌種群差異較為明顯，認為這種差異可能與pH值有關。

由此可見，經典硝化微生物具有多樣的種類和生態分布，它們大多都存在于土壤生態系統中，因此利用傳統和非傳統手段來研究土壤生態系統就顯得十分重要。

2 全程氨氧化(單步自養硝化)微生物

2.1 全程氨氧化(單步自養硝化)作用概念

表2 已描述的全程氨氧化微生物

注：表中未填寫部分代表該種微生物還未進行分類；加※的是未經過純培養的微生物。

2.2 全程氨氧化(單步自養硝化)微生物酶及其編碼基因

上述的3個科研團隊在發現了全程氨氧化微生物的同時，也對其關鍵的酶和相關編碼基因進行了解析。Pinto等[12]研究發現Nitrospira-Like Bacteria含有氨氧化所需的全部基因包括amoA、amoB、amoC、hao，但進行宏基因組測序發現，其amoA基因與編碼典型氨氧化菌(AOB和AOA)的氨單加氧酶(Amo)的amoA基因不同，也不同于編碼甲烷氧化細菌的甲烷單加氧酶基因，但與最近發現的編碼全程氨氧化微生物的氨單加氧酶基因卻處于同一簇之中。

Kessel等[10]研究發現CandidatusNitrospiranitrosa和CandidatusNitrospiranitrificans的基因組中含有編碼氨單加氧酶(Amo)和羥胺氧化還原酶(Hao)的全套基因以及編碼亞硝酸氧化還原酶(Nxr)亞基的基因。與已報道的經典硝化作用的微生物有所不同的是，Ca.N.nitrosa含有3個不連續的amoC編碼基因，其中一個amoC基因與另一個amoC基因有97.7%氨基酸同一性；Ca.N.nitrificans缺少第二個amoA基因，包含了4個額外的amoC基因和一個第二haoA基因；Ca.N.nitrosa有兩個nxrAB基因可以編碼同一個NxrB亞基，但是NxrA亞基的氨基酸有89.6%相似；Ca.N.nitrificans有4個幾乎一樣(氨基酸相似性>99%)的Nxr的α和β亞基[10]。

而對于CandidatusNitrospirainopinata，Daims等[11]研究結果則表明其擁有亞硝酸鹽氧化作用的關鍵酶-亞硝酸鹽氧化還原酶(Nxr)，其基因組包含nxrA和nxrB基因以及4個nxrC基因分別編碼Nxr的α、β、γ 3個亞基，它也擁有氨氧化標志性酶(Amo、Hao)的同系物，其amoA基因與典型的Amo的基因不同，Amo的3個亞基α、β和γ由一個amoCAB基因簇和另外兩個在其他基因位點的amoC基因編碼。由此可見，全程氨氧化微生物均含有與經典自養硝化微生物相同功能的氨單加氧酶(Amo)和羥胺氧化還原酶(Hao)，但是編碼這些功能酶的基因種類和序列均不相同。這些編碼基因的差異，尤其是amoA基因的不同，也許可以為全程氨氧化微生物設計出其特異性的分子生態學檢測工具。

2.3 自養硝化微生物(單步硝化)生態多樣性

到目前為止已經發現的4種全程氨氧化微生物存在于多種生態系統中[10-12]。Kessel等[10]研究發現在土壤生態環境如農田土壤、森林土壤，水域生態系統如濕地、稻田水域、淡水、湖泊以及活性污泥和飲用水處理系統等都有全程氨氧化微生物的存在。Gruber-Dorninger C等[36]對丹麥西奧爾堡和維也納的污水處理廠的污泥進行研究，發現占全部檢測到的細菌(7.5±3)%的硝化螺菌屬，比占(2.5±1.2)%的氨氧化細菌有優勢，且并未在基因數據集中發現有屬于奇古菌的序列。Lapara等[37]研究了美國明尼蘇達州St.Paul水廠的活性炭過濾池發現,占13%～21%的硝化螺菌屬種群豐度最高，AOB的amoA基因豐度小于0.07%，AOA的amoA基因并沒有發現。以上例子說明了在這些環境中可能存在有全程氨氧化微生物。董興水等[34]甚至認為全程氨氧化微生物廣泛分布于除海洋以外的其它環境中。

由此可見，進行單步硝化作用的全程氨氧化微生物豐富了硝化微生物的種類及其生態分布，這進一步啟發了人們對土壤中全程氨氧化微生物菌種資源的挖掘。

3 異養硝化微生物

3.1 異養硝化作用概念

異養硝化作用與自養硝化作用有一定不同，兩者不僅對能源和氮源的利用不同，還在底物的利用類型上有所不同，異養硝化作用的底物可以是無機氮也可以是有機氮，自養硝化作用的底物只能是無機氮。更有研究發現異養硝化作用過程中有機氮直接被氧化為硝酸鹽氮，而跨過了有機氮分解為氨氮、再養化為亞硝酸鹽氮的過程[38-42]。因此，異養硝化作用是異養微生物在好氧條件下將氨/銨或氧化態-3的有機態N氧化為羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程[5]。生態系統中常見的進行異養硝化的微生物如表3所示。不僅包括細菌的變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的部分類群，還包括了子囊菌門和擔子菌門的部分真菌類群。

3.2 異養硝化微生物酶

在異養硝化微生物進行異養硝化作用中已知的可能發揮作用的酶有以下幾種：1．氨單加氧酶(Amo)，該酶在Paracoccusdenitrificans和Pseudomonasputida等異養細菌中都已經被純化分離出來，分析分離純化的酶發現其由兩個亞基組成，其分子量與自養菌的氨單加氧酶的兩個亞基amoA和amoB類似[50]；但其與自養硝化作用中的Amo又有一定不同，如：1 mmol/L的乙炔并不能抑制該酶的活性[51]。2．羥胺氧化酶(Hao)，又稱羥胺-細胞色素C還原酶(Hydroxylamine cytochrome creductase)，已經在Pseudomonas屬和Arthrobacter屬等[52-53]菌種中純化分離出來，從現有研究結果來看，與自養硝化細菌的羥胺氧化酶存在明顯或部分不同的特點,如異養硝化細菌的Hao結構相對簡單,只是一個單體蛋白，并且不含血紅素[51]。3．丙酮酸肟加雙氧酶(Pyruvic oxime dioxyg-enase,Pod)，Ono等[54-55]在糞產堿桿菌中分離純化出了Pod，經分析發現該酶為115 kDa，含3個相同分子量的亞基(40 kDa)，每個亞基中含有一個Fe原子，維生素C的加入可以明顯加強酶活性，該酶反應的最適pH值為7.5[56]。盡管人們對異養硝化微生物的關鍵酶和編碼基因已有所認知，但是目前還沒有可以進行分子生態學特異性檢測的引物等工具，因此目前異養硝化微生物的研究還僅局限于單菌的分離和生理生化特征的檢測。

表3 生態系統中常見異養硝化微生物

3.3 異養硝化微生物生態多樣性

異養硝化微生物多存在于土壤、污泥、水體等環境中，土壤中的異養硝化微生物包括放線菌、真菌、細菌等[57]。其中真菌是異養硝化菌中數量最多、效率最高的[42]。同時具有異養硝化和好氧反硝化能力的這些異養硝化微生物，對于環境中氮的去除具有很好的應用前景[58]，因此對于異養硝化微生物研究的報道較多。孔強等[59]在天津北運河沉積物中分離純化出了3株異養硝化菌，其中兩株HN5和HN6為真菌，另一株NH4為細菌，經過16S rDNA序列和真菌ITS序列進行分子生物學鑒定，初步認為NH5和NH6為同一菌株Candidapalmioleophila，NH4為Shigella。張光亞等[39]從大棚土壤中分離純化出了一株異養型硝化細菌，命名為HN。

蘇俊鋒等[60]篩選出6株異養硝化細菌，將該6株菌運用到污水處理系統中，并采用PCR-DGGE方法對SBR(序批式活性污泥法)反應器中不同時期(第1 d、第15 d和第30 d)的群落結構動態變化進行研究，圖譜結果表明微生物群落結構進行了動態演替，在第1 d時群落結構變化不明顯，在第15 d時群落演替較快，在第30 d時具有最高的種群多樣性且形成了穩定的群落結構。

由此可見，異養硝化微生物具有多樣的種類和生境，其代謝途徑也并不單一，催化其反應的酶也多種多樣，運用多種技術對其進行研究就顯得尤為關鍵。

4 硝化微生物生態研究方法

4.1 硝化微生物的群落多樣性檢測方法

(1)末端限制性酶切片段長度多態性技術(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)是建立在聚合酶鏈式反應(PCR)技術和限制性片段長度多態性(RFLP)技術基礎之上發展起來的一種微生物群落分析技術，該技術具有分辨率高、易于實現自動化以及互聯網數據共享等優勢，通過對環境樣品總DNA提取，經過16S rDNA的PCR擴增，對產物進行酶切，由生物技術公司進行分析得到T-RFLP圖譜，根據圖譜分析計算多樣性指數和均勻度指數[61]。林煒鐵等[62]利用該技術，對富集反應器內硝化微生物群落的種群結構和多樣性進行解析，分別培養12、24、48 h后，根據OTU數量，對硝化細菌樣品中的多樣性指數以及均勻度指數進行計算，結果為：在分別培養12、24、48 h后多樣性指數分別為1.39、1.21、0.45，在分別培養12、24、48 h后均勻度指數分別為0.58、0.62、0.64。

(2)變性梯度凝膠電泳技術(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是可以檢測DNA點變異的一種方法，其原理是在聚丙烯酰胺凝膠(含有梯度變性劑)電泳過程中,可將長度相同的雙鏈DNA因其堿基排列順序不同而分離[63]，該技術在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面有一定作用。基于該技術，Kowalchuk等[64]研究堆積土中Proteobacteria門β亞綱中氨氧化菌的種群多樣性，研究表明β亞綱中的Nitrosospira是廣泛分布于自然界中的一類氨氧化菌，這類菌群可以由于土壤酸堿性的不同而出現明顯的差異。郭佳等[65]研究了三峽消落帶土壤培養的第0、13 d樣品。得到了亮度不等、數量不同且位置各異的電泳條帶，表明不同消落帶不同淹水-落干次數條件下的硝化微生物群落組成具有一定差異。

(3)基因序列文庫技術能夠提供更多物種間和混合種群中基因變化的特定信息。將環境樣品的總DNA進行PCR擴增，克隆全部基因片段并測序,建立基因序列文庫，從中隨機選擇克隆子進行測序和排列，通過對大量克隆子詳細序列信息的采集,能夠評估每個變異基因的相對比例,測定總基因多樣性和特定種群組成[66]。陳哲等[67]研究化肥對土壤硝化功能菌組成的影響，通過構建16S rDNA細菌的氨單加氧酶基因(amoA)文庫發現，長期單施肥導致細菌16S rDNA和amoA的多樣性明顯低于CK和NPK處理。

(4)高通量測序技術是因傳統的Sanger測序技術局限性日益突出，從而發展起來的一種測序方法，該技術可對數百萬個DNA分子進行同時測序，目前該技術包括以454技術(Roche公司)、Solexa技術(Illumina公司)以及Solid技術(ABI公司)為代表組成的第二代測序技術，還包括以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT為代表的單分子測序技術，可進行大規模平行測序、價格低廉以及具有定量功能是高通量測序技術的優點[68]。梁滬蓮等[69]基于高通量測序技術對4種硝化細菌富集培養物(以銨鹽為氮源的淡水富集物A、以亞硝酸鹽為氮源的淡水富集物B、以銨鹽為氮源的低溫淡水富集物C和以亞硝酸鹽為氮源的海水富集物D)的群落結構進行分析，發現4個樣品共檢測到24門47綱129屬，4個樣品的優勢菌門均為變形菌門；樣品 A、B、C的優勢菌綱為β-變形菌綱和γ-變形菌綱，樣品D的優勢菌綱為γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和芽孢桿菌綱；而優勢菌屬各不相同，其中樣品A為亞硝化單胞菌屬(24.56%)，樣品B為鏈霉菌屬(7.15%)，樣品C為噬菌弧菌屬(19.36%)和類諾卡氏菌屬(19.35%)，樣品D為嗜酸菌屬(13.6%)和柄桿菌屬(11.5%)。共檢測出7種具有硝化功能的細菌，其中樣品A、B和D中主要是亞硝化單胞菌屬，占比分別為24.56%、4.94%和0.63%，樣品C主要為Nitrospirillum(0.69%)和硝化螺旋菌屬(0.69%)。

4.2 硝化微生物的群落豐度檢測方法

(1)熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization,FISH)的原理是核酸堿基互補配對。用標記的DNA或者RNA探針與單鏈核酸序列互補配對，用熒光基團對探針進行直接標記并與目標序列結合，最后利用熒光顯微鏡直接觀察[70]。FISH技術檢測環境樣品中硝化細菌與傳統檢測方法相比具有快速、簡便、準確的優點，可以提供環境微生物數量和空間分布等多種信息[71]。朱琳等[71]用該方法對江蘇太湖、南京玄武湖、南京鎖金村污水處理廠活性污泥中硝化細菌分布進行分析，結果顯示，環境樣本中亞硝化細菌和硝酸菌含量分別是：太湖1.68×103、0.54×103cells/mL；玄武湖1.34×103、0.38×103cells/mL；鎖金村污水處理廠活性污泥8.30×106、0.52×106cells/g。

(2)實時熒光定量PCR技術(Real-time fluorscent quantitative PCR)具有可定量、特異性強、靈敏度高、速度快等特點，是一種檢測目的核酸拷貝數的可靠方法，利用該技術研究硝化微生物時，能夠對不同類群的氨氧化菌進行定量，從而達到對其在環境中的檢測，該方法是目前公認最準確的定量研究微生物種群的方法[72]。應用該技術，吳沿友等[73]解析了硝化細菌在泉州灣濕地中不同區域和不同植被土壤中的數量變化規律，結果表明，不同區域和不同植被土壤中硝化桿菌屬、硝化螺菌屬、亞硝化單胞菌屬硝化細菌的相對數量有顯著差異，有植被的土壤高于空地和裸地。

5 展望

硝化微生物存在于各種土壤生態系統中，它與土壤生態系統中的氮素循環密切相關，同時也涉及到一定的生態環境問題。因此，運用多種研究手段，研究不同土壤生態系統中硝化微生物的種類和多樣性就顯得十分重要，具有一定的生態學意義。隨著科學的發展，高通量測序技術、原位分離技術、質譜檢測技術等多重技術的聯合應用將為探索硝化微生物的生態學作用提供有力的支持。基于這些多重的分析技術，研究者們有望解決硝化微生物研究中的諸多熱點和難點問題，例如：

(1)氨氧化古菌的發現引起了學界對于其機理、種類等方面研究的熱潮，近年來我國學者賀紀正等對于氨氧化古菌方面的研究具有較大突出貢獻。鑒于AOA產生N2O的機理以及催化該過程的酶的不確定，以及AOA難以純化培養等問題，未來利用基于高通量測序的宏基因組學手段，在土壤原位條件下研究氨氧化古菌的時空演變等生態特征，評估它們在硝化作用和產生溫室氣體N2O的相對貢獻等問題，都將是未來的研究熱點。

(2)單步硝化作用的發現使得人們對硝化作用的過程有了新的認識，單步硝化作用將是未來一段時間內學界對于硝化作用研究的一大熱點。但是由于其研究起步較晚，所以有很多亟待解決的問題如：全程氨氧化微生物的代謝機理過程是如何進行的；全程氨氧化作用的影響因子有哪些；能否開發全程氨氧化微生物的特異性研究方法；全程氨氧化微生物在土壤，尤其是農田土壤氮素轉化過程中是否發揮著一定的作用等一系列問題均可能成為接下來的研究熱點。

(3)異養硝化-好氧反硝化菌由于具有同時硝化反硝化(SND)的特性，使得其對土壤和水體中多余氮素的除去具有一定作用，這將是今后的研究熱點之一。但是其代謝過程尚未形成統一的定論，不同的菌株表達的酶系不同，代謝途徑也有所不同。為了更好的指導與異養硝化有關的生物脫氮技術，需要解析不同的異養硝化微生物硝化機理和不同的異養硝化微生物的酶及其功能基因作用機理等問題，如此才能將異養硝化-好氧反硝化菌高效合理的應用于實際。