冷等離子體種子處理對銅脅迫下小麥種子萌發與幼苗生長的影響

鄧 敏，趙 玲，滕 應*，劉 方，徐勇峰，3，任文杰，孟 珂，3，馬文亭

（1.貴州大學資源與環境工程學院，貴陽 550025；2.中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室，南京土壤研究所，南京 210008；3.中國科學院大學，北京 100049）

目前，我國農田土壤重金屬污染嚴重[1]，其中銅（Cu）是我國《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》[2]列出的8個重金屬污染元素之一。Cu離子具有易遷移性、高蓄積性、持久性等特點[3]，易于通過食物鏈的生物放大給人類及其他動物健康帶來潛在危害[4-5]。2014年《全國土壤污染調查公報》公布了我國土壤中Cu的點位超標率達到2.1%[6]。Cu在土壤中的正常含量一般在20～30 mg·kg-1之間，但是在污染嚴重的地區，如銅礦區附近[7]，Cu濃度超過了5000 mg·kg-1，遠遠超過土壤環境質量標準[2]。Cu雖然是植物體內許多關鍵酶的輔基，也是植物生長發育所必需的營養元素之一[8-10]，但是過量的Cu會抑制根系生長，對植物萌發和幼苗生長造成影響[11]。研究發現，低濃度Cu（≤50 mg·L-1）可促進小麥種子萌發和幼苗生長[12]，而高于50 mg·L-1時[13]，根的生長會受到明顯的抑制，更高濃度（300～500 mg·L-1）時，根的生長只停留在瘤狀物階段，呈黑色或焦黃。通常，Cu離子主要積累在植物的根系，不易向地上部分轉移。因此，Cu含量過高時，植物首先受損的是根系，最嚴重的也是根系[8]。

小麥作為我國重要糧食作物，種子萌發時期幼苗的生長狀況對作物生長及產量有重要的影響[14]，因而提高小麥種子在萌發時期對重金屬的耐受性，緩解重金屬對小麥種子萌發時期的毒害作用就顯得尤為重要。傳統的種子處理技術有γ射線、激光、電場、磁場等[15-21]，但上述物理源在實際應用過程中，還存在一定的局限性，如設備要求高或對環境造成一定的污染等。因此有必要探索一種新的種子處理技術，以適應實際生產需求。

冷等離子體種子處理技術是近年來國際上發展的一種新型種子處理技術[22]。與傳統種子處理技術相比，該技術操作簡單、省時省力、處理成本低，且對環境無污染，具有非常高的農業應用價值[23-24]。經冷等離子體種子處理后的作物種子，其發芽率、幼苗生長都有顯著提高[25]，能夠達到增產的目的[26-27]，并且能增強作物在抗旱、抗凍及耐鹽等方面的抗逆性[28]。但迄今為止，冷等離子體種子處理技術應用于提高作物抗重金屬脅迫下種子萌發與幼苗生長的研究還未見報道。因此，本文以3個品種的小麥種子為研究對象，研究不同功率的冷等離子種子處理對小麥種子萌發與幼苗生長抗重金屬Cu脅迫能力的影響，以期為冷等離子體種子處理技術用于提高重金屬污染農田的安全生產提供理論依據和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試小麥品種蘇麥188、寧麥15、蘇麥128均購自江蘇省農業科學研究院。CuSO4·5H2O（分析純）購于上海金山亭新化工試劑廠。一次性塑料發芽盒規格為12 cm×12 cm×5 cm。

1.2 冷等離子體處理裝置

本研究采用次大氣輝光放電處理機（HPD-2400）對3種小麥種子進行處理，其放電原理如圖1所示。

圖1 冷等離子體放電原理Figure 1 The principle of cold plasma discharge

1.3 冷等離子體處理方法

冷等離子體種子處理功率分別為：250、500、750、990 W，處理時長為180 s[29-30]，以未經過冷等離子體處理的種子作為對照（CK）。參照魯先文等[12]的報道，Cu脅迫濃度設為10、50、200 mg·L-1，分別代表低、中、高3個濃度。

1.4 萌發實驗

種子萌發實驗參照國家農作物種子檢驗規程發芽試驗（GB/T 3543.4—1995）[31]進行，每個實驗設置3個重復。具體操作：每個發苗盒鋪設兩層濾紙，加入不同濃度的CuSO4溶液，每個培養皿均勻擺放50粒種子，置于（25±1）℃恒溫培養箱中發苗，每天觀測并統計種子的發苗數（以胚苗長度達到種子長度一半為種子萌發的判斷標準）。每天加蒸餾水1 mL，保證水分充分供應，培養到第7 d，測定其根長、苗長等數值。

1.5 觀測項目及測定指標

1.5.1 發苗特性[32]

（1）發芽率G=7 d發苗種子數/供實驗種子數×100%。

（2）發芽指數Gi=∑（Gt/Dt）

式中：Gt為t日的發苗數，Dt為相應的發苗天數。

（3）活力指數VI=發芽指數×總長。

（4）根長、苗長。

1.5.2 幼苗根、苗Cu含量測定[33]

本次實驗采用濕式消解法消解：將小麥連根取出，先用自來水沖冼干凈，然后用蒸餾水沖掉表面的自來水，用剪刀將根部與苗部分開，用濾紙吸干水分，在75℃條件下烘干至恒重。在研缽中分別將根、苗磨碎，用分析天平準確稱取0.200 0 g上述處理后的樣品，分別裝入消解管中，然后向每個消解管中加入濃硝酸2.4 mL、過氧化氫0.8 mL，放入105℃烘箱中消解6 h。消解完成后，轉移并定容到15 mL，然后用一次性注射器和0.45 μm濾膜過濾，將過濾后的溶液用ICP-MS測定其中Cu的含量。每組樣品均進行3次平行實驗。

重金屬Cu轉移系數和富集系數的計算公式[34]為：

轉移系數=根部含量（mg·kg-1）/苗部含量（mg·kg-1）

富集系數=植物體含量（mg·kg-1）/溶液中含量（mg·kg-1）

1.6 統計分析

數據采用IBM SPSS Statistics 19軟件進行ANO?VA統計分析，采用LSD（L）和Duncan（D）法進行方差和差異顯著性檢驗。

2 結果分析

2.1 冷等離子處理對Cu脅迫下小麥種子發芽率和發芽指數的影響

圖2反映了冷等離子處理對不同Cu濃度作用下蘇麥188、寧麥15、蘇麥128種子發芽率的影響。在相同冷等離子體處理條件下，Cu濃度從10 mg·L-1增加到200 mg·L-1時，蘇麥188、蘇麥128種子發芽率變化不顯著，而寧麥15種子的發芽率整體上受到了一定的抑制，最大降幅為8.5%。冷等離子體種子處理對Cu脅迫下小麥種子發芽有一定的促進作用，但整體促進作用不大。

當Cu濃度為10、50 mg·L-1時，種子經250 W冷等離子體處理后，相比對照處理，蘇麥188的發芽率有一定提高，增幅分別為3.0%和5.6%，達到了顯著差異水平；經500 W冷等離子體處理后，寧麥15的發芽率相比對照提高了4.6%和4.7%，且呈現出顯著性差異。

圖2 冷等離子處理對Cu脅迫下3種小麥種子發芽率的影響Figure 2 Effects of cold plasma treatment on the germination rate of three wheat seeds under Cu stresses

在相同處理功率下，不同品種的小麥在Cu脅迫下的發芽率存在一定的差異。250 W的冷等離子體處理整體上對蘇麥188的發芽率有一定提高，但對寧麥15、蘇麥128的發芽率影響不大，甚至產生負效應。同樣，500 W的冷等離子體處理對寧麥15的發芽率有一定提高，但對其他兩個品種小麥的發芽無影響。

圖3 冷等離子處理對Cu脅迫下3種小麥種子發芽指數的影響Figure 3 Effects of cold plasma treatment on the germination index of three wheat seeds under Cu stresses

冷等離子體處理對不同Cu濃度作用下蘇麥188、寧麥15、蘇麥128種子發芽指數的影響見圖3。在相同等離子體處理條件下，隨著Cu脅迫濃度的增加，小麥種子的發芽指數呈下降的趨勢，在200 mg·L-1Cu脅迫下的寧麥15發芽指數較10 mg·L-1時Cu脅迫下降幅最大為12.5%。

種子經990 W冷等離子體處理后，相比對照處理，10 mg·L-1Cu處理下蘇麥188和寧麥15的發芽指數有一定的提高，增幅分別為10.2%和10.3%；但是對中高濃度Cu脅迫下的小麥發芽指數幾乎無影響。其他冷等離子體處理功率對不同Cu脅迫下3種小麥發芽指數的影響也不顯著。整體而言，冷等離子體種子處理對Cu脅迫下的小麥發芽指數影響不顯著。

2.2 冷等離子體處理對Cu脅迫下小麥根長、苗長的影響

冷等離子體處理對Cu脅迫下蘇麥188、寧麥15和蘇麥128根長、苗長的影響如圖4所示。在對照處理中，Cu脅迫濃度越高，小麥根、苗生長受到的限制作用越明顯，與10 mg·L-1Cu脅迫濃度的結果相比，高濃度200 mg·L-1Cu作用下小麥根長和苗長的降幅最大，分別為37.4%和54.8%。

冷等離子體處理對Cu脅迫下小麥的根長、苗長有顯著的促進作用：當Cu脅迫濃度為10 mg·L-1時，與對照相比，500 W處理下寧麥15根長和苗長分別提高了46.2%和37.1%。當Cu脅迫濃度為50 mg·L-1時，同樣，500 W的處理對蘇麥188、寧麥15的根長和苗長都有明顯的促進作用，其中蘇麥188的根長和苗長分別增加了18.5%和4.7%，而寧麥15的根長和苗長分別增加了15.1%和75.5%；250 W處理下蘇麥128的根長和苗長分別提高了19.3%和145.4%。當Cu脅迫濃度達200 mg·L-1時，不同功率的冷等離子體處理對3種小麥的根長和苗長的促進效果都很顯著，其中250 W的處理對蘇麥128的根長和苗長分別提高了15.1%和29.1%；500 W處理下蘇麥188根長和苗長分別提高了20.0%和99.0%，寧麥15的根長和苗長也有19.2%和19.4%的提高。這表明適宜功率的冷等離子體處理對不同Cu脅迫濃度下的小麥幼苗生長均起到了明顯的促進作用。

在相同的處理功率下，不同品種的小麥在Cu脅迫下的根長、苗長存在一定的差異。500 W的冷等離子體處理下蘇麥188、寧麥15的根長和苗長均有顯著提高，但對蘇麥128的影響不顯著。同樣，250 W的冷等離子體處理下蘇麥128的根長和苗長有明顯提高，但對其他兩個品種根長和苗長的影響不明顯。說明不同品種的小麥適宜的冷等離子體功率不同。

2.3 冷等離子體處理對Cu脅迫下小麥活力指數的影響

圖5為冷等離子體處理對Cu脅迫下蘇麥188、寧麥15、蘇麥128活力指數的影響。在對照處理下，Cu脅迫濃度越高，小麥的活力指數下降得越明顯：50 mg·L-1Cu脅迫與10 mg·L-1Cu脅迫相比，蘇麥188、寧麥15和蘇麥128的活力指數分別下降了47.9%、46.4%和53.9%；而在200 mg·L-1Cu脅迫下，活力指數下降幅度更加明顯，分別為69.5%、59.3%和66.6%。

圖4 冷等離子處理對Cu脅迫下小麥種子根長、苗長的影響Figure 4 Effects of cold plasma treatment on roots and sprouts of wheat under Cu stresses

圖5 冷等離子處理對Cu脅迫下小麥種子活力指數的影響Figure 5 Effects of cold plasma treatment on vigor index of wheat under Cu stresses

冷等離子體處理提高了不同Cu脅迫濃度下3種小麥種子的活力指數：當Cu濃度為10 mg·L-1時，與對照處理相比，500 W處理下寧麥15的活力指數提高了49.0%；當Cu脅迫濃度為50 mg·L-1時，500 W的處理使蘇麥188、寧麥15的活力指數分別增加了12.4%和64.6%，而250 W處理下蘇麥128的活力指數提高了82.1%；當Cu脅迫濃度達200 mg·L-1時，相比于對照處理，500 W的處理使蘇麥188、寧麥15的活力指數分別增加了42.7%、19.4%，而250 W的處理使蘇麥128的活力指數增加了38.0%。由此可見，適宜功率的冷等離子體處理能增強不同Cu脅迫濃度下小麥種子的活力指數。

在相同的處理功率下，不同品種的小麥在Cu脅迫下的活力指數存在一定的差異。500 W的冷等離子體處理對蘇麥188、寧麥15的活力指數均有顯著提高，但對蘇麥128的影響不明顯，甚至產生負作用。同樣，250 W的冷等離子體處理對蘇麥128的活力指數有顯著提高，但對其他兩個品種影響不明顯。

2.4 冷等離子體處理對小麥幼苗根、苗Cu富集的影響

表1為冷等離子體處理對小麥幼苗根、苗中Cu富集特征的影響。從表1可以看出：無論是對照處理還是冷等離子體處理，隨著Cu脅迫濃度增加，3種小麥幼苗根、苗中的Cu含量均有不同程度地升高，且Cu的富集系數均表現為根＞苗。同時，與對照處理相比，在Cu脅迫濃度為10 mg·L-1和50 mg·L-1時，冷等離子體處理整體上促進了根、苗對Cu的吸收，最高增幅分別達到了111.1%和26.3%；在Cu脅迫濃度為200 mg·L-1時，冷等離子體處理對Cu的吸收既有促進也有抑制，表現出不確定性；但是不同品種的小麥幼苗對Cu的轉移系數卻都呈現出升高的趨勢，其中蘇麥188和寧麥15的升幅較明顯，而蘇麥128的升幅不顯著。由此可見，在低濃度Cu脅迫時，冷等離子體處理能夠促進根和苗對Cu的吸收；在高濃度Cu脅迫時，冷等離子體處理在一定程度上提高了幼苗將根部的Cu轉運到苗部的能力，從而減輕了Cu對根部的毒害作用。

表1 冷等離子體處理對小麥幼苗根、苗中Cu富集的影響Table 1 The effect of cold plasma treatment on the accumulation of copper in the root and seedling of wheat seeds

3 討論

由于Cu是植物體內許多關鍵酶的輔基，是植物生長發育所必需的營養元素，因此，低劑量的Cu脅迫能夠促進植物體內酶的合成，維持植物的正常新陳代謝[35]。但是，高濃度Cu脅迫對植物的生長發育有明顯的抑制及毒害作用，例如抑制小麥的萌發、生長、細胞分裂與酶活性，進而影響小麥的光合作用和呼吸作用[36]。本研究也發現了類似的結果，即高濃度Cu存在時可明顯抑制小麥種子的萌發與幼苗生長。而采用適宜功率冷等離子體處理雖然不能明顯提高Cu脅迫作用下不同小麥種子的發芽率和發芽指數，但在一定程度上提高了小麥種子的活力指數，促進了小麥幼苗的生長，例如本研究結果呈現的小麥根長、苗長和活力指數較對照處理組的最大增幅分別為46.2%、145.4%和82.1%（圖4和圖5），這與報道的等離子體促進常規萌發條件下小麥種子萌發生長的結果類似[37-38]。據報道，冷等離子體處理可以提高種子中過氧化物酶、α-淀粉酶、琥珀酸脫氧酶等酶的活性，使種子呼吸作用增強，生物氧化過程加快，物質的合成與運輸能力加速進行[39]，這可能也是本研究中冷等離子體處理增強小麥種子抗Cu脅迫作用的原因。

冷等離子體處理對種子萌發與作物生長影響的機制尚未完全清晰，Li等[40]從水分的吸收和酶活性等角度進行了探索。本研究從重金屬吸收的角度對冷等離子體的作用機理進行了初步探索，在低濃度Cu作用時，冷等離子體在一定程度上能夠促進根、苗對Cu的吸收，提高種子活力，Cu可參與到幼苗的生理生長過程中，對幼苗早期的生長發育起到了積極作用[41]；在高濃度Cu作用時，冷等離子體能夠提高幼苗對Cu的轉運能力，在一定程度上減輕了Cu對幼苗根部的毒害作用，從而促進了幼苗生長。

從不同功率冷等離子體處理的結果可以看出，不同小麥品種對冷等離子體的敏感性及耐受性存在明顯差異。因此，該技術在今后實際應用時，需要根據作物品種確定適宜的冷等離子體功率。

4 結論

（1）隨著Cu脅迫濃度的增加，未作冷等離子體處理的3種小麥種子的萌發和幼苗生長均表現出明顯的抑制作用，冷等離子體種子處理可以有效緩解這種抑制作用。

（2）冷等離子處理對小麥在Cu脅迫作用下的發芽率、發芽指數影響不大，但是對根、苗的生長以及種子活力指數均有一定的提高。

（3）低濃度Cu脅迫下，冷等離子體能夠促進幼苗對Cu的吸收，提高種子的活力；高濃度Cu脅迫時，冷等離子體處理能在一定程度上提高幼苗將根部的Cu轉運到苗部的能力，減輕Cu對幼苗根部的毒害作用，從而促進幼苗的生長。