砷氧化菌DWY-1的分離鑒定及其修復砷污染水稻土的可能機理

周武先，段媛媛，游景茂，趙詩晨，盧 超 ，羅孝榮，張美德*

（1.湖北省農業科學院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2.湖北省農業科技創新中心中藥材研究分中心，湖北恩施 445000；3.南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095；4.作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京 210095）

砷（As）是一種有毒的類金屬元素，其氧化物三氧化二砷（As2O3）俗稱“砒霜”。過量攝入As或長期暴露在As污染的環境中可誘發皮膚、腎臟、膀胱等器官和組織的癌變[1]，患癌幾率大幅上升[2]。我國屬于水稻種植大國，含As灌溉水的使用，導致我國南方一些水稻種植地區的As污染已經相當嚴重[3]，而水稻根系的高效硅運輸通道使其對As的吸收大大增加[4]。世界范圍內，特別是水稻種植區，稻米已經成為食物鏈中As的主要來源[5-7]，因此As污染水稻土的修復工作顯得尤為重要。

目前，As污染土壤的修復主要采用物理法和化學法[8-9]，物理化學方法相對簡單，但成本較高，且容易造成二次污染[10]，因而運用高效綠色的生物方法具有重要意義。無機砷中三價砷[As（Ⅲ）]的毒性最強，并且As（Ⅲ）在多數環境下相比于五價砷[As（Ⅴ）]更難以被吸附[11-12]。在一定條件下，微生物可以將As（Ⅲ）氧化為As（Ⅴ），從而降低As的移動性和毒性[13]。好氧條件下，莫于婷等[14]篩選的砷氧化菌As-I、As-Q能高效將1.3 mmol·L-1的As（Ⅲ）氧化為As（Ⅴ），其氧化率可達99%。厭氧條件下，Zhang等[15]分離的砷氧化菌Paracoccus sp.SY能夠將1 mmol·L-1的As（Ⅲ）完全氧化，同時將As氧化與硝酸鹽還原過程進行偶聯，從中獲得能量維持自身的生長。無論在好氧還是厭氧條件下，As污染水稻土中均存在大量砷氧化菌，在As污染水稻土的修復技術中，利用微生物的As（Ⅲ）氧化作用對As污染水稻土進行修復具有潛在的應用價值[15-16]。目前有關As污染水稻土的微生物修復的研究較多，但對其修復機理的研究還較少。

水稻土在淹水的過程中，厭氧環境使土壤中的As易被活化[7，17]。在淹水條件下，水稻土孔隙水中的As（Ⅴ）含量理論上占總As的10%～30%，但研究人員發現水稻土淹水后孔隙水中的As（Ⅴ）含量遠超過理論值，說明水稻土淹水后As的轉化雖然以還原反應為主，但仍可能存在氧化過程[18]。本文以全國不同地區的As污染水稻土為研究對象，從中篩選砷氧化菌，并進行分離和鑒定，同時開展菌株對As（Ⅲ）的耐受性及其As氧化特性研究并模擬其在淹水條件下對As污染水稻土的修復作用，為As污染水稻土的微生物修復提供依據以及探索淹水條件下砷氧化菌修復As污染水稻土的可能機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用土壤為湖北黃石、湖南郴州、廣東汕頭等地的As污染水稻土，風干后過20目篩測定pH值，過100目篩測定總As含量，測定結果見表1。

表1 各地As污染水稻土的總As含量和pH值Table 1 Total As and pH value of different As-contaminated paddy soil

供試培養基：LB培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、MSM培養基（Mineral salts medium）、CDM培養基（Chemically defined medium），可參照Zhang等[15]的方法配置。所有化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

供試儀器：紫外分光光度計UV2450；高效液相電感耦合等離子色譜NexIon300X；電子分析天平BSAD4S-CW；PCR擴增儀EDC-810；微量分光光度計NanoDrop 2000c。

1.2 菌株DWY-1的生理生化特性及分子鑒定

砷氧化菌的篩選采用KMnO4檢測法[19]，選取具有代表性的砷氧化菌DWY-1作為后續研究的試驗對象，接種到LB固體培養基，30℃培養48 h后進行生理生化檢測，檢測內容包括：革蘭氏染色、V.P測定、吲哚的產生、硝酸鹽還原反應、水解反應（脲素、七葉靈、山梨醇）和碳源利用情況（葡萄糖、精氨酸、甘露醇、麥芽糖、蘋果酸、苯乙酸）。測定方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[20]。

以菌株DWY-1的總DNA作為模板，分別使用引物 27F/1492R[21]和 aoxBM1-2F/aoxBM3-2R[22]進行 16S rDNA基因和砷氧化酶基因（aioA）的擴增。將純化的目的片段送武漢奧科生物技術有限公司測序，測定的目的基因序列提交到NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得相應的登錄號。使用Nucleotide Blast的方法將目的基因與基因庫中的序列進行比對，下載最相似菌株序列作為系統發育樹的參考序列。采用MEGA 5.1軟件中ClustalW的方法進行多序列比對，用鄰接法（Neighbor-Joining Tree）進行系統發育分析，系統發育樹各分支置信度由自舉分析方法（Bootstrap）檢驗，重復1000次。

1.3 菌株DWY-1的As（Ⅲ）抗性及在不同濃度As（Ⅲ）中的生長情況

配制CDM培養基（pH值7.0～7.4），亞砷酸鈉的濃度梯度為：0、0.5、1、2、3 mmol·L-1和5 mmol·L-1，接種菌株后30 ℃、200 r·min-1搖床培養24 h，測定OD600nm值。

配制含0、0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）的CDM培養基，將菌株DWY-1接種到含不同濃度亞砷酸鈉的CDM培養基中，30℃、200 r·min-1搖床培養48 h，測定OD600nm值。

1.4 菌株DWY-1的As（Ⅲ）氧化特性

以NaHCO3為碳源（10 mmol·L-1）配制含0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）的MSM培養基（不添加KNO3）。接種菌株DWY-1到培養基中，每個濃度均設置不加菌處理作為對照，每個處理3個重復，從接種后開始，48 h內每隔6 h測定一次As形態。

以NaHCO3為碳源（10 mmol·L-1）配制含0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）的MSM培養基（添加1 mmol·L-1KNO3），接種菌株DWY-1，通入N2/CO2（80∶20，V/V）的混合氣體制造厭氧環境后開始，7 d內每隔1 d測定一次As形態。試驗結束后測定培養基中硝態氮的濃度（NO-3的測定采用酚二磺酸紫外分光光度法，NO-2的測定采用N－[1－萘基]－乙二胺光度法）。

1.5 菌株DWY-1對As污染水稻土的修復作用

選取黃石As污染水稻土為試驗對象，稱取50 g水稻土和50 mL的蒸餾水到100 mL的血清瓶，通入N2/CO2（80∶20，V/V）的混合氣體制造厭氧環境后放置在室溫下進行厭氧培養3 d。將菌株DWY-1在厭氧的MSM培養基（含5 mmol·L-1和10 mmol·L-1NaHCO3）中培養到OD600nm=0.5左右，取10 mL菌液12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用0.85%的NaCl溶液洗3遍，將菌體重懸到2 mL 0.85%的NaCl溶液中，投入到血清瓶（整個過程在微生物厭氧工作臺操作），同時準備一組不加菌液（用2 mL 0.85%的NaCl溶液代替）的處理作為陰性對照，繼續在室溫下培養14 d，每個處理設置4個重復。培養結束后將血清瓶中的懸浮液倒掉，泥漿8000 r·min-1離心10 min，上清液過 0.22 μm濾膜，立即取 1 mL 1.5 mol·L-1的 HNO3溶液加入到9 mL的濾液中保存As形態[15，23]；用0.6 mol·L-1的磷酸和 0.1 mol·L-1的抗壞血酸混合液提取吸附在水稻土底泥中的As[15，24]，離心后上清液過0.22 μm濾膜，用相同方法保存濾液，上HPLC-ICP-MS測定As形態。

1.6 數據統計與分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05）。使用Origin 8.1軟件作圖，TRAP軟件計算EC50。采用Primer 5.0和MEGA 5.1進行基因序列的整理和系統發育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 菌株DWY-1的分離、生理生化特性

從全國各地的As污染水稻土中共計分離出6株具有As氧化功能的菌株（表2），其中一株擴增出As氧化酶基因（aioA），命名為DWY-1。菌株DWY-1為中華根瘤菌屬（Sinorhizobium sp.），DY-1、DY-6、DY-9為短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.），ST-8、CZ-5為紅球菌屬（Rhodococcus sp.）。

由表3可知，菌株DWY-1的硝酸鹽還原呈陽性，其他反應均呈陰性。能夠利用葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等作為碳源進行生長。綜上可得DWY-1為革蘭氏陰性菌，具有多種生長代謝途徑。

表2 菌種信息表Table 2 Information of As（Ⅲ）oxidizing bacteria

表3 菌株DWY-1的生理生化測定Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain DWY-1

將目的基因16S rDNA以及aioA提交到NCBI，在Genbank中獲得相應的序列登錄號，分別為MH253882（16S rDNA）和MH283867（aioA）。將測序得到的16S rDNA基因在NCBI上通過BLAST檢索與Genbank中的核酸序列進行比對，并下載同源性序列構建系統發育樹進行分析（圖1A）。發現DWY-1與苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）及費氏中華根瘤菌（Sinorhizobium fredii）的相似性均為100%，基于菌株DWY-1的16S rDNA序列構建的系統發育樹顯示，其與Sinorhizobium sp.DAO10的親緣關系最近。將菌株DWY-1的As氧化酶基因aioA翻譯成氨基酸序列，在NCBI上進行比對并下載同源性較高的序列構建系統發育樹（圖1B），發現其與Sinorhizobium sp.KGO-5親緣關系最近，綜上認定菌株DWY-1為中華根瘤菌屬（Sinorhizobium sp.）。

2.2 菌株DWY-1的As（Ⅲ）抗性及在不同濃度As（Ⅲ）中的生長曲線

如圖2所示，菌株DWY-1培養24 h后，不加As處理的菌株生長狀況最佳，OD600nm達到0.449，其次為0.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理，OD600nm為 0.361，當 As（Ⅲ）的濃度達到5 mmol·L-1時，菌株DWY-1的生長受到嚴重抑制，培養24 h后仍處于調整期，OD600nm僅為0.014。不同濃度的As處理間均存在顯著性差異（P＜0.05）。利用TRAP軟件模擬As（Ⅲ）對菌株DWY-1的半抑制濃度，得出EC50=1.59 mmol·L-1。

經過48 h的培養，DWY-1在不添加As（Ⅲ）的CDM培養基中生長的最好（圖3），OD600nm值達到2.02；其次為0.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理，OD600nm=1.98，兩者沒有顯著性差異。當As（Ⅲ）的濃度達到1.0 mmol·L-1時，對DWY-1的生長產生了明顯的抑制作用，且隨著As（Ⅲ）的濃度增高，調整期逐漸延長。培養48 h 后 1.0 mmol·L-1和 1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理的OD600nm分別為 1.68和 1.24，與0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 菌株DWY-1的As氧化特性

圖2 不同濃度As（Ⅲ）對菌株DWY-1生長的影響Figure 2 Effects of different concentrations of As（Ⅲ）on growth of strain DWY-1

圖3 菌株DWY-1在不同濃度As（Ⅲ）中的生長曲線Figure 3 Growth curves of strain DWY-1 in CDM medium containing different concentrations of As（Ⅲ）

圖1 基于16S rDNA序列（A）及砷氧化酶氨基酸序列（B）構建的系統發育樹Figure 1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences（A）and aioA amino acid sequences（B）of strain DWY-1 and related sequences which were retrieved from NCBI

如圖4A所示，好氧條件下，DWY-1可以在24 h內將0.5 mmol·L-1的As（Ⅲ）完全氧化為As（Ⅴ），36 h內氧化1.0 mmol·L-1的As（Ⅲ），48 h內氧化1.5 mmol·L-1的As（Ⅲ）。厭氧條件下（圖4B），DWY-1可以在4 d內完全將0.5 mmol·L-1的As（Ⅲ）的氧化為As（Ⅴ），6 d內氧化 1.0 mmol·L-1的 As（Ⅲ），7 d內氧化 1.5 mmol·L-1的As（Ⅲ），無論在好氧條件下還是厭氧條件下，未加菌的對照組均未檢測到As（Ⅴ）。厭氧培養結束后，0.5、1.0、1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理的培養基中剩余的 NO3-濃度分別為 0.793、0.597、0.387 mmol·L-1，NO-3的去除率分別為20.7%、40.3%以及59.7%，培養結束后未檢測到NO-2（圖4C）。

2.4 菌株DWY-1對As污染水稻土的修復作用

從圖5可以看出，未添加菌株DWY-1的對照組（CK）培養兩周后土壤孔隙水（圖5A）和土壤底泥（圖5B）中磷酸可提取態的As仍以As（Ⅲ）為主，分別為2.80 mg·L-1和 45.54 mg·kg-1，占總 As的 75.7% 和91.3%。而添加菌株DWY-1處理的土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態的As以As（Ⅴ）為主，分別為1.73 mg·L-1和 24.37 mg·kg-1，占總砷的 69.6% 和72.8%。添加菌株DWY-1的土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態的As（Ⅲ）含量與CK相比分別降低73.0%和80.0%，總As含量分別降低32.6%和32.9%。

3 討論

圖4 菌株DWY-1在好氧（A）和厭氧（B）條件下As氧化特性以及厭氧條件下硝態氮濃度變化（C）Figure 4 Oxidiation of As（Ⅲ）by strain DWY-1 under aerobic condition without（A）or anaerobic condition with 1 mmol·L-1as the electron acceptor（B）and nitrate removel under anaerobic condition（C）

在自然環境中，As（Ⅲ）可以被氧氣等通過化學反應緩慢的氧化為As（Ⅴ），但是在微生物的作用下，As（Ⅲ）的氧化速率大幅提高[25]。As（Ⅴ）相比于As（Ⅲ）的移動性更小，毒性更低，因此微生物介導的As氧化被認為是As污染土壤修復的主要途徑之一[16，26]。環境中存在一些微生物能夠抵抗高濃度的As，甚至可以從As（Ⅲ）氧化與As（Ⅴ）還原的過程中獲得能量用于自身生長，這些微生物在大自然中普遍存在且在As的地球化學循環過程中發揮了重要作用[27-29]。本研究從As污染水稻土中分離出一株砷氧化菌DWY-1，最高可抵抗 5.0 mmol·L-1的 As（Ⅲ）。對菌株DWY-1進行鑒定發現其屬于中華根瘤菌屬（Sinorhi?zobium sp.），與其親緣關系最近的菌株Sinorhizobium sp.DAO10和Sinorhizobium sp.KGO-5均具有As氧化功能，且菌株DAO10也能將厭氧As氧化與硝酸鹽還原過程進行偶聯[28]，但其對As污染水稻的修復作用尚未見報道。對菌株DWY-1的生理生化特性進行研究，發現菌株DWY-1為革蘭氏陰性菌，能利用多種碳源進行生長，在好氧條件下和厭氧條件下均具有As（Ⅲ）氧化功能。

有研究表明，部分砷氧化菌可通過耦合As（Ⅲ）氧化與硝酸鹽還原過程并從中獲得能量用于自身生長[15，28]。Chen等[30]通過對水稻施用不同的氮肥，發現氮肥的施用可以減少水稻對As的吸收，這很可能是依賴于硝酸鹽還原進行As氧化的微生物造成的。在對菌株DWY-1的As氧化特性進行研究時發現其在好氧條件下和厭氧條件下均具有As氧化功能，并且厭氧條件下氧化As（Ⅲ）的同時伴隨著硝酸鹽還原。厭氧培養結束后，培養基中未檢測到NO2-的存在，且的去除率與As（Ⅲ）的消耗量成正比，根據化學計量學分析，發現菌株DWY-1的As氧化與硝酸鹽還原過程存在如下反應：8H++H2O（實驗得出消耗的As3+和比值為2.47±0.05，與理論消耗比值2.5沒有顯著性差異），推測被還原為N2，在以往的研究中，類似的菌株已有報道[15，28]。研究表明，好氧條件下，砷氧化酶AioA位于細胞的周質空間，As（Ⅲ）經甘油水蛋白或離子通道進入菌體細胞的周質空間后被氧化為As（Ⅴ），并釋放兩個電子，電子傳遞路徑為As（Ⅲ）傳遞兩個電子到大亞基AioA的鉬蝶呤輔因子，接著經分子鍵傳遞給[3Fe-4S]簇，然后到小亞基AioB的[2Fe-2S]簇，再到細胞色素C蛋白AioC，最后到呼吸鏈的O2，完成整個好氧As氧化過程[31-32]。然而Rhine等[33]在厭氧砷氧化菌Sinorhizobium sp.DAO10中也擴增出As氧化酶基因（aioA），說明As氧化酶AioA可能同時負責好氧As氧化以及厭氧As氧化過程。本研究在兼性厭氧菌株DWY-1的基因組DNA中也擴增出As氧化酶基因（aioA），再次證實了這一觀點。有研究報道，厭氧條件下，反硝化細菌中的硝酸還原酶（NAR）的電子供體為醌氫類，亞硝酸還原酶（NIR）的電子供體為細胞色素Cytbc1[34]。對于菌株DWY-1能夠在厭氧條件下將As（Ⅲ）氧化與硝酸鹽還原進行偶聯，筆者提出以下猜想（圖6）：As3+傳遞電子到大亞基AioA的鉬蝶呤輔因子，然后經分子鍵傳遞到[3Fe-4S]簇，再到小亞基AioB的[2Fe-2S]簇，此時一部分電子傳遞給醌氫類（QxHy），再傳遞到硝酸還原酶（NAR），NAR將電子傳遞給并將其還原為；另外一部分電子先傳遞給細胞色素Cytbc1，然后再傳遞到亞硝酸還原酶（NIR），在NIR的作用下接受電子并被多次還原最后生成氮氣（N2），從而完成As（Ⅲ）氧化協同硝酸鹽還原的整個過程。

水稻土中As的氧化作用可以促進土壤溶液中的五價As與鐵的氧化物或氫氧化物共沉淀，降低As的生物有效性和移動性[7，35]。在模擬菌株DWY-1修復As污染水稻土的過程中，發現接種菌株DWY-1處理的土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態的總As含量相比于對照分別降低32.6%和32.9%，As（Ⅴ）占總As的百分比分別從24.2%和8.7%提高到69.6%和72.8%。推測菌株DWY-1在淹水水稻土中將As（Ⅲ）氧化成As（Ⅴ），部分As（Ⅴ）與鐵氧化物形成共沉淀，致使土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態As的含量降低，這與李思妍等[36]的研究結果相符。根據As（Ⅲ）與硝態氮反應的方程式來看，As（Ⅲ）的氧化過程需要的硝態氮不多，且在水稻土中As是微量元素，而氮是大量元素，所以推測菌株DWY-1在氧化As（Ⅲ）的過程中，土壤會溶出一部分的硝態氮，促進了菌株DWY-1的厭氧As氧化與硝酸鹽還原過程。

在研究的過程中，還發現5株未擴增出As氧化酶基因但具有As氧化功能的菌株，包括嗜吡啶紅球菌（Rhodococcus pyridinivorans）、泡囊短波單胞菌（Bre?vundimonas naejangsanensis）和赤紅球菌（Rhodococcus ruber）等，推測此類微生物在As污染水稻土中大量存在且在As的氧化還原過程中扮演著重要角色。適當改善As污染水稻土中有利于此類微生物生長的因素，如添加合適的碳源、調節土壤酸堿度、鹽濃度以及添加適量的硝酸鹽[37]或種植有利于此類微生物生長的植物都可能促進土壤中的As氧化過程，從而降低土壤中As的移動性和生物有效性。

4 結論

（1）砷氧化菌DWY-1對As污染水稻土具有較強的修復作用，在淹水土壤中厭氧培養14 d后，添加菌株DWY-1處理的土壤孔隙水和底泥中磷酸可提取態的As（Ⅲ）含量與對照（不加菌）相比分別降低73.0%和80.0%，總As含量分別降低32.6%和32.9%，表明菌株DWY-1可作為修復As污染水稻土的潛在菌種資源。

圖5 菌株DWY-1對土壤孔隙水（A）和底泥（B）As形態的影響Figure 5 Effect of strain DWY-1 inoculation on As speciation in the soil solution（A）and the phosphoric acid-extractable fraction in a flooded soil slurry（B）

圖6 厭氧條件下As氧化與硝酸鹽還原偶聯的猜想Figure 6 Supposed process of anaerobic As（Ⅲ）oxidation coupled to denitrification

（2）菌株DWY-1在好氧和厭氧條件下均具有As氧化功能，且在厭氧培養過程中，As3+和NO3-存在如下反應：說明砷氧化菌DWY-1可以耦合厭氧As氧化與硝酸鹽還原并從中獲得能量用于自身生長，此過程可作為修復As污染水稻土的途徑之一。