蜈蚣草內生及根際砷還原菌的表征

王 姣，田海霞，和文祥

（西北農林科技大學資源環境學院，農業部西北植物營養與農業環境重點實驗室，陜西 楊凌 712100）

砷（As）是一種有毒的類金屬，可通過自然環境作用或人類活動釋放到環境中[1-2]，并對人類健康造成極大的威脅[3]。其中無機砷主要以五價砷[As（V）]和三價砷[As（Ⅲ）][4-5]形態存在，二者生物毒性相差60～80倍。由于環境條件的變化，會導致土壤中砷形態的轉化，此過程極有可能受到砷還原菌的調控。國內外學者對砷還原菌開展了研究工作，如Krumova等[6]從5個土樣中分離出27株變形菌門（Proteobacteria）的抗砷菌，兼具氧化和還原能力；Chang等[7]從砷污染土壤中分離出Citrobacter sp.NC-1，24 h內可將固相中的As（V）還原為具有更高遷移性的As（Ⅲ），與硫化物或亞鐵離子結合從而降低其移動性。目前公認的砷還原機制有兩種，包括呼吸和解毒機制[8]。As（V）進入好氧砷還原菌后，在細胞內被還原為As（Ⅲ）并排出體外，實現砷解毒作用。這一過程由染色體[9]或質粒[10]編碼的ars操縱子調控，具體包括3～5個基因（arsR，-D，-A，-B，與-C）[11]。研究表明，好氧砷還原菌可以控制砷的遷移轉化，促進沉積物中砷的釋放[7]。因此，好氧砷還原菌的多樣性及其在砷地球化學循環中的重要調控作用受到了廣泛關注。

對砷而言，蜈蚣草是一種理想的修復植物。但目前關于蜈蚣草砷富集研究主要集中于體內砷還原酶及砷轉運機制[12]，對微生物在蜈蚣草砷富集過程中的作用研究尚處于初始階段。已有研究表明，微生物在促進蜈蚣草砷富集能力的同時，還可以提高蜈蚣草的生物量。Ghosh等[13]將根際菌與蜈蚣草共培養，提高了蜈蚣草對砷的攝入量（18.1～35.3 mg·kg-1），并且蜈蚣草的生物量有所增加[1.5～3.4 g（dw）]。Yang等[14]也有類似的發現，在添加砷還原菌后，蜈蚣草的生物量增加了53%，砷吸收量增加了44%。Han等[15]在加入抗砷菌之后，蜈蚣草的砷和磷吸收量分別增加了47%和69%，且生物量增加了20%～74%。蜈蚣草體內及根際土壤中分布著大量的抗砷及砷還原菌，但是目前相關研究較少，且分離出的抗砷菌種類十分有限。

本文從蜈蚣草體內及根際土壤中分離抗砷菌，以期不斷擴充砷還原菌的種類，加強對砷還原菌群分布的認識，并對其砷還原效率和機制進行表征，進一步探明它們在抗砷及砷的地球化學循環中的重要作用，為砷污染土壤中的微生物-植物聯合修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蜈蚣草及其根際土壤采自湖南石門地區的雄黃尾砂礦區（29°38′55″N，111°01′46″E），其中蜈蚣草連根采集裝入樣品袋；振蕩除去粘附根系的松散土壤后，刮下緊緊粘附在根系的土壤作為根際土壤，保存于塑封袋中[16]；用大量自來水沖洗附著在植物樣品表面的塵土，最后用去離子水沖洗干凈備用。所有樣品存儲于4℃冰箱保存備用。

1.2 抗砷菌的篩選和鑒定

1.2.1 抗砷菌的篩選

本試驗選用4種培養基，分別為含20 mmol·L-1砷酸鈉的寡營養培養基（BCM和YCM）與富營養培養基（TYEG和BPM），具體成分見表1。蜈蚣草內生抗砷菌的分離方法如下：稱取3 g植物樣品，移入超凈工作臺后，用75%酒精消毒處理，并用手術刀剪碎至5 mm片段，充分研磨后[17]，再分別加入30 mL的4種培養基。

篩選根際土壤中抗砷菌時，稱3 g土樣分別加入30 mL的4種培養基。兩類菌均采取如下兩種培養方法。直接稀釋法：將混合培養物充分振蕩混勻后取1 mL液體進行稀釋，吸取不同稀釋度的100 μL稀釋液進行平板涂布。馴化法：將上述混合物于30℃、150 r·min-1下振蕩培養12 h，取樣品3 mL再次轉接入相同的無菌培養基中，重復3次后進行平板涂布。通過劃線培養挑取單菌落，再轉接入相應的培養基進行二次劃線培養，挑取的單菌落保存至含30%甘油的培養基中，置于-80℃冰箱備用。

1.2.2 抗砷菌的16S rRNA鑒定

利用LB（Luria-Bertani）液體培養基對保存菌株進行活化培養，10 000 r·min-1下離心10 min后收集菌體。采用細菌基因組試劑盒（Omega，美國）提取細菌總DNA后，PCR擴增儀（Eppendorf，德國）擴增各菌株16S rRNA序列。所用引物為27F（5′-AGAGTT?GATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGT?TACCTTTTACGACTT-3′），隨后1×TAE-1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。膠回收試劑盒（Omega，美國）回收PCR產物后，按常規步驟克隆后由擎科公司（北京，中國）進行DNA測序，利用NCBI的BlastN程序進行序列比對，確定鑒定結果。

表1 分離抗砷菌的培養基配方Table 1 The component of four mediums used in the isolation experiment

1.3 抗砷能力及還原基因鑒定

1.3.1 抗砷菌的As（Ⅴ）與As（Ⅲ）抗性

本試驗采用最大生長抑制濃度（Minimum inhibi?tory concentration，簡稱MIC）來表征菌株的砷抗性[7]。具體方法如下：利用LB液體培養基對保存菌株進行活化。同時配制50 mL含砷的LB液體培養基，As（Ⅴ）和 As（Ⅲ）的濃度分別為 0～500 mmol·L-1與 0～50 mmol·L-1。將對數生長期的菌液100 μL接入上述含砷培養基中，于150 r·min-1、30 ℃條件下培養48 h，利用紫外分光光度計（HACH DR2800，美國）測定其OD600。

1.3.2 砷還原基因（arsB，arsC）鑒定

將保存菌株利用LB液體培養基活化培養至對數期后，離心收集菌體。用細菌基因組試劑盒（Omega，美國）提取其DNA，采用表2中引物擴增目的基因片段。陽性PCR產物采用膠回收試劑盒（Omega，美國）回收，按常規步驟克隆后由擎科公司（北京，中國）進行DNA測序，利用NCBI的BlastN程序進行序列比對。

1.4 砷還原率及累積率測定

將保藏菌液接種于LB液體培養基活化培養至對數期后，取100 μL菌液于含1 mmol·L-1As（Ⅴ）的LB培養基中，150 r·min-1、30 ℃下培養24 h后，取1 mL混合培養液于5000 r·min-1離心5 min，收集上清液。同時設置無菌處理為對照。用高效液相色譜-原子熒光聯用儀（HPLC-AFS）（吉天，中國）測定上清液中As（Ⅴ）與As（Ⅲ）的濃度，計算菌株的砷還原率與累積率。

表2 arsBC引物序列[18]Table 2 The primer sequences used in the detection of arsBC genes

還原率=（CAs（Ⅲ）/CT-As）×100%

累積率=（C0-CT-As/C0）×100%

式中：C0為初始砷濃度；CAs（Ⅲ）為加入菌株反應24 h后的As（Ⅲ）濃度；CT-As為加入菌株反應24 h后的總砷濃度。

1.5 系統發育樹構建

通過NCBI查詢并獲得構建發育樹所需的參考序列。將所有序列通過Clustal X2程序編輯成相同片段長度后，利用MEGA6.0軟件中的Neighbor_Joining方法構建系統發育樹[19]。本研究所得DNA序列已全部提交至GenBank數據庫，序列號分別為MG759526～MG759548（16S rRNA）；MG765306～MG765326（arsC）及MG765327～MG765328（arsB）。

2 結果與分析

2.1 砷抗性菌分離和鑒定

從蜈蚣草體內及根際土壤共篩選分離到23株砷抗性菌，結果見表3與表4。寡培養基和富培養基中分別獲得10、13株菌；馴化培養法和直接稀釋法各分離出13、10株抗性菌；而且18株和5株分別分離自根際土壤和蜈蚣草體內。23株菌歸屬于兩個門：變形菌門（Proteobacteria，其中γ-Proteobacteria，16株；α-Proteobacteria，2株）、厚壁菌門（Firmicutes，5株），涉及10個屬。其中13株菌來自假單胞菌屬（Pseudomo?nas）。

表3 23株抗砷菌的分離培養基及培養方法Table 3 The culture media and methods used for 23arsenic-resistant strains

為確定抗砷菌的分類學地位，測定其16S rRNA序列，經與NCBI數據庫比對發現所有抗砷菌與已報道模式菌的同源性高達99%。并對23株抗砷菌的16S rRNA構建了系統發育樹（圖1），表明所有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）的菌株同源性高，親緣關系近，只存在種間差異；來自微小桿菌屬（Exiguobacteri?um sp.）的兩株菌S13和S17也存在類似關系。解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum sp.）和土壤桿菌（Agrobacterium sp.）不同屬序列之間也顯示了較高的一致性，這可能是因為它們來源于相距較近的類群。

2.2 砷抗性菌的抗性、還原率和累積率

23株抗性菌對As（Ⅴ）、As（Ⅲ）的耐受濃度截然不同，其濃度范圍分別為 80～150 mmol·L-1與 5～30 mmol·L-1（表5）。比較各個菌株對不同價態砷的抗性可以發現，其對As（Ⅴ）與As（Ⅲ）的抗性能力并未呈現出一致性。如菌株S4和P1對As（Ⅴ）和As（Ⅲ）抗性最高，而S16雖然可耐受30 mmol·L-1的As（Ⅲ），但其抗As（Ⅴ）能力相對較小，耐受濃度僅為80 mmol·L-1。

各菌株的砷還原及累積特性差異較大，砷還原率范圍為0%～100%，砷累積率為3%～79%。其中19株抗砷菌的砷還原率均低于20%，砷累積率低于50%。僅有4株菌（Pseudomonas sp.S2、Pseudomonas sp.P3、Staphylococcus sp.S14與Agrobacterium sp.P1）同時表現出較高的砷還原率（81%～100%）與累積率（75%～79%），表明這幾株菌在砷污染土壤的生物修復中具有較大的應用潛力。

2.3 砷還原基因arsBC

對23株菌的arsBC基因進行擴增，結果表明，從21株菌可擴增出arsC基因，而僅在2株菌中擴增出arsB基因。綜合比較23株菌的砷抗性特征發現，arsC基因是抗砷菌中普遍存在的還原基因，但并非砷還原率及抗性的決定性因素。分別將21個arsC和2個arsB序列與GenBank中的參比序列比對，構建相應氨基酸的系統發育樹（圖2和圖3）。結果表明，21株菌的arsC序列與已驗證的砷還原酶arsC親緣關系較近。菌株S1、S15和S6在16S rRNA結果中顯示為不同屬（圖1），但其arsC基因的相似度高達99%，說明arsC基因在進化過程中可能保守性較高或存在相關的水平轉移。而arsB的系統發育樹結果發現，菌株S7和S14的arsB存在于不同分支，親緣關系較遠。

表4 23株抗砷菌16S rRNA的鑒定結果Table 4 16S rRNA identification of 23 arsenic-resistant bacteria

3 討論

3.1 抗砷菌的多樣性

本研究共篩選獲得來自10個屬的23株抗砷菌，其中5個屬（Pseudomonas、Acinetobacter、Exiguobacteri?um、Bacillus與Lysinibacillus）在其他眾多文獻中被報道為抗砷菌[18，20-21]。不同于以往的研究中僅選用單一培養基及培養方法[22]，本研究同時采用了4種培養基及2種培養方法篩選蜈蚣草體內及根際土壤抗砷菌，獲得比以往研究更為豐富的菌種資源。富營養培養基（TYEG與BPM）與馴化培養法在篩選抗砷菌方面稍顯優勢（表3），在未來的抗砷菌分離中可優先采用。同時我們發現假單胞菌屬（Pseudomonas）是抗砷菌的重要來源，這與前人研究結果相近。如Krumova等[6]在研究中分離出27株抗砷菌，其中20株都來自假單胞菌屬；Ghosh等[13]從蜈蚣草根際土壤中分離到7株菌，其中5株來自假單胞菌屬。而侯運楠、潘建華等[23-24]對該5個屬的重金屬抗性研究中，發現其對外界環境表現出極強的適應力，因此廣泛擁有抗砷能力可能是這些微生物適應惡劣環境的表現之一。而針對其他5個屬（Cedecea、Pseudochrobactrum、Staphylo?coccus、Stenotrophomonas與 Agrobacterium），則鮮有報道其為抗砷菌。

表5 抗砷菌的抗性能力、抗性基因、還原率及累積率Table 5 Arsenic resistance，ars genes，reduction and accumulation rate of resistant strains

從不同分離來源來看，本研究中18株菌分離自根際土壤，僅5株菌為蜈蚣草內生菌，而Han等[25]從蜈蚣草中分離的根際菌和內生菌數量比達到17∶20。兩者差異性可能來自于篩選培養基中的砷脅迫濃度不一致。Han等[25]在分離抗砷菌的培養基中添加的砷濃度僅為75 mg·L-1，而本文中為了研究高抗性的砷還原菌，所添加的砷濃度為20 mmol·L-1。此外，分離結果顯示67%的根際抗砷菌來源于變形菌門（Proteo?bacteria），其中61%屬于γ-變形菌綱（γ-Proteobacte?ria），其余 33%來源于厚壁菌門（Firmicutes），這與Huang等[26]的研究結果一致，他們同樣發現γ-變形菌綱是抗砷菌的主要來源（84%）。但Han等[27]的研究卻發現α-變形菌綱（α-Proteobacteria）和β-變形菌綱（β-Proteobacteria）占所分離抗砷菌的80%，并且微生物群落結構組成主要取決于土壤有機質含量而非砷含量。因此，可以推斷抗砷菌主要來源的差異可能由分離土壤的性質差異引起的。另一方面發現5株蜈蚣草內生菌全部來自變形菌門，這與前人研究結果也存在一定差異性，如Zhu等[28]從蜈蚣草中分離的內生菌全部歸屬于厚壁菌門。Rajendran等[29]發現內生菌的不同歸屬同樣與土壤的性質密切相關，認為植物組織的內生菌可能來源于植物根際，并由此進入植物組織的內部，而植物根部長時間與土壤接觸，因此土壤的性質差異也會間接影響植物內生菌的群落結構。

圖2 arsC氨基酸序列的系統發育樹Figure 2 Phylogenetic tree constructed from arsC amino acid sequences of 21 As（Ⅴ）-resistant bacteria

3.2 高效砷還原菌的砷還原及累積特性

目前對好氧砷還原菌株已有很多報道，但對高效砷累積菌株研究較少。本研究發現4株菌：Pseudomo?nas sp.S2、Pseudomonas sp.P3、Staphylococcus sp.S14和Agrobacterium sp.P1除了具有高效的砷還原能力，還可累積75%以上的砷（1 mmol·L-1），遠高于其他砷累積菌株。Majumder等[30]發現Bacillus sp.HGH-21在25 mg·L-1的As（Ⅴ）濃度中培養3 d后的累積率僅為25.6%。Takeuchi等[31]發現M.communis在含5 mg·L-1的 As（Ⅴ）培養基中，可積累 2290 μg·g-1As。因此，基于這4株菌表現出的高累積能力，有必要深入探究其累積部位、形態及機理，以及與砷濃度、培養時間等的關系，優化其累積效率并將其應用于砷的生物修復。

圖3 arsB氨基酸序列的系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree constructed from arsB amino acid sequences of 2 As（Ⅴ）-resistant bacteria

以往研究發現砷還原菌的還原能力與砷抗性有關。Zhu等[28]發現，在1 mmol·L-1As（Ⅴ）條件下，砷還原能力與抗性呈負相關，而在10 mmol·L-1As（Ⅴ）濃度下，砷還原能力與抗性呈顯著正相關。而在本研究中，菌株砷抗性在任何濃度下都并未與砷還原率呈現顯著的相關性，可能是由于這些長期處于砷污染環境中的土著細菌，為了保護細胞免于毒害，表達出了特異性蛋白并與砷結合，降低了砷的毒性，進一步增強細胞的抗砷性[12]。另外，Chen等[32]發現甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和有機砷化物外排透性酶（arsJ）共同作用也可將As（V）外排。Zhu等[33]發現arsN表達出一種類似乙酰基轉移酶的蛋白影響砷抗性。Bacillus sp.CDB3編碼的5種蛋白（arsR3TO1O2N）也與砷抗性有關[34]。另一方面，菌株砷還原能力很大程度上并不依賴于arsC基因的表達。本研究雖在21株菌中擴增出arsC基因，但并非均表現出還原功能，因此砷還原能力與相關基因之間可能存在的關系還有待進一步探究。

4 結論

（1）本研究從蜈蚣草內及其根際土壤中共分離到23株砷抗性菌，涉及2個門，10個屬，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）為優勢菌群。

（2）在23株砷抗性菌中，4株菌被鑒定為高效砷還原及累積菌，砷還原率和累積率分別達到81%以上和75%以上。

（3）從21株抗砷菌中檢測到arsC還原基因，而僅從2株菌中擴增出arsB基因，關于砷還原能力與基因表達之間的關系有待進一步探究。