作物輪作對谷田土壤理化性質及谷子根際土壤細菌群落的影響

牛倩云，韓彥莎，徐麗霞，張艾英，儀慧蘭*，郭二虎*

（1.山西大學生命科學學院，太原 030006；2.山西省農業科學院谷子研究所，山西 長治 046000）

谷子是我國北方地區的主栽作物之一，在農業生產中占據重要地位，但由于耕地有限、種植模式不合理的影響，導致連作障礙普遍發生。連作障礙是指在同一塊土壤中連續種植同種作物，導致作物長勢變弱、產量降低、品質下降等現象[1]。研究表明，發生連作障礙的原因主要有以下幾點：土壤養分失衡；土壤pH值降低；土壤微生物群落結構變化，有害微生物增加[2-3]。輪作是農業生產中常用的一種種植制度，合理輪作能夠平衡土壤養分，改變土壤理化性質，增加作物產量，有效避免或減少連作障礙的發生。

土壤酶參與土壤養分的固定和釋放，以及各種氧化還原反應，其活性是評價土壤肥力的重要參數之一[4]。土壤微生物主導土壤生態系統中的養分循環和能量流動，對于維持系統穩定性和可持續性有重要意義[5]。研究表明，輪作不僅有助于提高土壤酶活性，對土壤微生物組成和結構多樣性也有明顯促進作用。李銳等[6]發現長期棉花連作使農田土壤酶活性下降，微生物多樣性降低，而輪作可提高土壤過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和蔗糖酶活性以及微生物群落結構多樣性；于高波等[7]報道小麥、毛苕子與黃瓜輪作明顯改善了根際細菌組成，且土壤CAT、PPO和脲酶活性顯著升高；王勁松等[8]研究表明高粱-苜蓿輪作能增加土壤蔗糖酶活性和微生物多樣性。

迄今為止，關于輪作能改善土壤質量、緩解連作障礙的報道很多[6-9]，但谷子作為山西省優勢特色雜糧作物，具有耐瘠薄、適應性強等特點，是否可以建立某種輪作模式避免連年種植帶來的不利影響，尚待研究。因此，本研究設置谷子連作、馬鈴薯-玉米-谷子輪作、玉米-大豆-谷子輪作和大豆-馬鈴薯-谷子輪作4個處理，監測不同種植模式下土壤養分和酶活性變化特征，并利用Illumina MiSeq測序技術對谷子根際土壤細菌多樣性進行分析，明確不同種植模式對土壤生態環境的影響，為谷田種植模式優化和農業可持續生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗在山西省長治市山西省農業科學院谷子研究所的谷子試驗田進行（113°06′E，36°11′N），試驗地所在區域日平均氣溫28℃，夜平均氣溫18℃。供試土壤為淺黏綿壚土，含堿解氮27.56 mg·kg-1、有效磷 15.01 mg·kg-1、速效鉀 93.30 mg·kg-1，有機質 15.43 g·kg-1，pH 7.14。

試驗開展前該田塊為谷子連作土壤，于2012年開始輪作試驗，選用的4種輪作作物分別是：谷子（Se?taria italica，Si）、玉米（Zea mays，Zm）、馬鈴薯（Sola?num tuberosum，St）和大豆（Glycine max，Gm）。共設四種不同種植模式：谷子連作（Si-Si-Si）、馬鈴薯-玉米-谷子輪作（St-Zm-Si）、玉米-大豆-谷子輪作（Zm-Gm-Si）和大豆-馬鈴薯-谷子輪作（Gm-St-Si），具體試驗方案見表1。每種種植模式3次重復，隨機區組排列，每個小區面積為30 m2，株間距35 cm，每公頃留苗30萬株。2012—2015年各小區管理施肥相同，施肥水平均為氮肥（N）150 kg·hm-2、磷肥（P2O5）150 kg·hm-2、鉀肥（K2O）30 kg·hm-2，播種前將40%氮肥和全部磷肥、鉀肥作為基肥施入，其余氮肥于谷子拔節期追肥，谷子追肥時給同期田間種植的馬鈴薯、玉米和大豆施用等量氮肥。

表1 試驗設計Table 1 Design of experiment

1.2 土樣采集及指標測定

1.2.1 土樣采集

于2014年谷子拔節期，每個小區隨機選3個采樣點，每個樣點隨機選取長勢一致的5棵植株，挖取植株根周5 cm范圍內的全部根系，用手輕抖植株根系，去除附著土，用軟毛刷刷取根部的根際土，過20目篩后裝于自封袋，-80℃保存，用作土壤微生物多樣性檢測。同期，隨機選各小區3個點，采集0～20 cm的耕層土壤，去除雜物，過20目篩后裝于自封袋，4℃保存，用作土壤基本理化性質和酶活性測定。

1.2.2 土壤pH和養分測定

土壤pH測定采用電位法。土壤養分測定參照魯如坤[10]的方法，采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量，鉬銻抗比色法測定土壤有效磷含量，火焰光度法測定土壤速效鉀含量，重鉻酸鉀法測定土壤有機質。

1.2.3 土壤酶活性測定

土壤酶活性檢測參照關松蔭[11]的方法。過氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法測定，以20 min后1 g土壤消耗1 mL 0.02 mol·L-1高錳酸鉀所需要的酶量定義為1個酶活力單位（mg·g-1，FW）；多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯三酚法測定，以2 h后1 g土壤中產生1 mg紫色沒食子素所需要的酶量定義為1個酶活力單位（mg·g-1，FW）；纖維素酶活性采用硝基水楊酸比色法測定，以72 h、1 g土壤中產生1 mg葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位（mg·g-1，FW）；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸法測定，以24 h、1 g土壤中產生1 mg葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位（mg·g-1，FW）。

1.2.4 產量測定

2014年谷子成熟時按小區實收記產，然后折算成公頃產量。

1.2.5 土壤微生物多樣性檢測

使用OMEGA公司生產的E.Z.N.A Soil DNA試劑盒，按照試劑盒的使用說明提取和純化土壤微生物基因組DNA。將純化后的基因組DNA作為PCR模板，擴增細菌16S rDNA的V4區，使用的引物是520 F：5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′；802R：5′-TAC?NVGGGTATCTAATCC-3′。PCR擴增條件為：95℃預變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，25個循環后，72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，目的條帶用Qiagen公司生產的QIA?quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒切膠回收。回收的DNA送上海派森諾生物科技股份有限公司進行測序，測序平臺為Illumina MiSeq。對原始數據進行優化，去除引物序列、低于150 bp的序列和低質量的序列；只保留重疊超過10 bp且沒有錯配的序列。在0.97相似度下利用QIIME軟件對操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）進行聚類分析，并制作維恩圖；基于樣品的OTU數量進行Alpha多樣性分析，計算 Chao、Ace、Shannon 指數[12-14]；在門和屬水平上對樣品OTU進行聚類，對聚類后各樣品所含的不同OTU序列做柱狀圖和熱圖。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2010進行數據統計，采用SPSS 19.0進行數據分析，通過Duncan方法對不同處理組之間的數據進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 土壤pH和土壤養分

在三種輪作模式下，土壤pH值和堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質的含量均發生改變（圖1）。與連作相比，pH值在三個輪作處理中均升高（圖1A）；堿解氮含量Gm-St-Si顯著升高，St-Zm-Si、Zm-Gm-Si無顯著改變（圖1B）；有效磷含量Gm-St-Si中最高，Zm-Gm-Si差異不顯著，St-Zm-Si降低（圖1C）；速效鉀含量在Gm-St-Si和Zm-Gm-Si中均升高，其中Gm-St-Si最高，增幅34.4%，St-Zm-Si差異不顯著（圖1D）；有機質含量三個輪作處理均顯著升高（圖1E）。

2.2 土壤酶活性

酶活性檢測結果顯示，輪作會影響土壤CAT、PPO、纖維素酶和蔗糖酶活性。CAT活性在輪作處理中顯著提高，但三個輪作處理間未表現顯著差異（圖2A）；PPO活性在St-Zm-Si和Gm-St-Si中最高，Zm-Gm-Si次之，連作最低（圖2B）；纖維素酶活性呈現Gm-St-Si＞Zm-Gm-Si＞St-Zm-Si＞Si-Si-Si的趨勢，其中Gm-St-Si是連作的3.25倍（圖2C）；蔗糖酶活性在Gm-St-Si、Zm-Gm-Si和 St-Zm-Si中顯著升高，分別比連作高29.48%、13.23%和8.91%（圖2D）。綜上表明，與谷子連作相比，輪作后各土壤酶活性均處于較高水平，其中Gm-St-Si輪作的效果最顯著。

2.3 谷子產量

統計四種種植模式下谷子的產量，結果顯示，輪作處理的谷子產量均高于連作，但只有Gm-St-Si達到顯著水平，較連作高37.11%，Zm-Gm-Si和St-Zm-Si比連作高31.08%和27.52%（圖3）。

2.4 土壤細菌群落結構

2.4.1 OTU聚類分析

在相似度0.97的水平上對測序所得序列進行聚類，共得到8750個OTU。如圖4所示，Si-Si-Si、St-Zm-Si、Zm-Gm-Si和Gm-St-Si組的OTU數分別為4519、4692、4970個和5745個，具體排序為Gm-St-Si＞Zm-Gm-Si＞St-Zm-Si＞Si-Si-Si，三個輪作處理的OTU數均高于連作，Gm-St-Si處理最高，為連作的1.27倍。

2.4.2 Alpha多樣性分析

圖1 四種種植模式下的土壤pH（A）和堿解氮（B）、有效磷（C）、速效鉀（D）、有機質（E）含量Figure 1 Soil pH（A）and the contents of alkaline hydrolysis nitrogen（B），available phosphorus（C），potassium（D），and organic matter（E）under four cropping systems

本研究考察的Alpha多樣性指標包括豐富度指數（Chao、Ace）和多樣性指數（Shannon）（表2）。Chao值在 Gm-St-Si中最高，St-Zm-Si、Zm-Gm-Si與連作間無顯著差異。與連作相比，Ace值在Gm-St-Si和Zm-Gm-Si中顯著增加，St-Zm-Si差異不顯著；Shan?non值在Gm-St-Si中顯著升高，Zm-Gm-Si中顯著下降，St-Zm-Si差異不顯著。與谷子連作比較，Gm-St-Si的Chao值、Ace值和Shannon值均呈現升高趨勢。

2.4.3 門水平上的細菌群落結構分析

檢出的細菌主要包括8個門，Verrucomicrobia（疣微菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Planctomycetes（浮霉菌門）、Gemmatimonade?tes（芽單胞菌門）和Chloroflexi（綠彎菌門），四種種植模式下根際土壤細菌各門類的豐度有明顯差異（圖5）。與連作相比，三個輪作處理含有更豐富的疣微菌門、酸桿菌門和浮霉菌門。其中，疣微菌門在Zm-Gm-Si和Gm-St-Si中較豐富，酸桿菌門在Gm-St-Si中含量較多，浮霉菌門在Gm-St-Si中豐度最高。

2.4.4 屬水平上的細菌組成聚類分析

圖2 四種種植模式下的土壤酶活性Figure 2 Soil enzyme activities under four cropping systems

圖3 2014年谷子產量Figure 3 Yield of millet in 2014

圖4 四種種植模式下土壤OTU分布維恩圖Figure 4 Venn diagram showing the distribution of OTU of soil samples under four cropping systems

表2 四種種植模式下根際土壤細菌群落的Alpha多樣性指數Table 2 Alpha-diversity index of rhizosphere bacterial community under four cropping systems

在屬的水平上對樣品所含菌屬進行聚類，分析其細菌組成的相似性和多樣性。由圖6可知，不同作物輪作后土壤的細菌群落結構發生改變，其中Si-Si-Si和St-Zm-Si聚為一支，都含有豐富的厚壁菌門和放線菌門，Zm-Gm-Si和Gm-St-Si聚為一支，以變形菌門和浮霉菌門為主。與連作相比，三個輪作處理的Planctomyces、Gemmata、Flavisolibacter、Luteolibacter菌群豐度增加，Gm-St-Si處理增加的幅度最大，其中Planctomyces豐度比連作提高了1.16倍，Gemmata豐度提高了1.14倍，Flavisolibacter豐度是連作的1.87倍，Lu?teolibacter豐度是連作的3.89倍；而Flavobacterium、Lu?teimonas菌群豐度在Gm-St-Si中降低（圖7）。

3 討論

圖5 基于門水平的細菌組成分布圖Figure 5 Bacteria community distribution based on the level of phylum

適當的輪作方式能改善土壤理化性狀，有效避免土壤酸化，還能均衡土壤中的營養元素，平衡養分含量[1-2]。本研究結果表明，輪作后土壤有機質含量和pH值均有所升高，土壤肥力增加，土壤微生物多樣性提高，有利于作物的生長發育和增產。在種植大豆的輪作組中，土壤堿解氮含量顯著增加，可能與豆類作物的固氮作用有關，大豆能固定空氣中的無機氮，增加土壤氮含量[15]；而在St-Zm-Si處理中，土壤有效磷含量較低，可能是前茬種植玉米對磷肥消耗較多所致。前人研究報道，前茬種植玉米會導致農田磷含量下降[16]，我們的結果與此一致。

土壤理化性狀和酶活性是衡量土壤肥力的重要指標，兩者共同作用推動土壤代謝過程，影響作物生長，土壤酶來源于植物根系分泌物和土壤微生物，易受土壤環境因子的影響[4]。輪作為農田生態系統提供了較高的植物多樣性，使土壤微生物多樣性增加，并提高土壤酶活性。前人研究表明，土壤中CAT、PPO活性與植株抗病性呈正相關；纖維素酶和蔗糖酶是碳循環中的關鍵酶，對土壤有機質利用有重要意義[6]。本研究結果顯示，輪作使土壤CAT、PPO、纖維素酶和蔗糖酶活性升高，有利于增強植株抗病性和對土壤養分的利用。

圖6 基于屬水平的細菌組成聚類分析Figure 6 Cluster analysis of bacteria community based on the level of genus

圖7 基于屬水平的細菌相對豐度Figure 7 Relative abundance of the dominant genus

土壤微生物參與土壤多種重要的生物化學過程，其群落的結構及組成直接影響土壤微生態系統穩定和平衡，進而影響作物正常生長發育。土壤微生物主要由細菌、真菌和放線菌組成，其中細菌是數量最多的一個類群，參與有機質分解、氨化反應等多種生物學過程[8]。在土壤中，根際微生物與植物根系分泌物之間的相互作用是一個重要的過程，根系通過分泌多種化合物，對根際微生物發揮促進或抑制作用，進而對微生物群落結構產生影響[5]。輪作作為一種常見的農業技術，可使幾種作物的根系分泌物、作物殘體在土壤中積累，豐富了土壤微生物的營養物質，促進根際微生物群落的多樣性。在本研究中發現三種輪作模式下谷子根際微生物多樣性提高，與前人結果一致。

谷子根際土壤細菌多樣性分析發現，輪作處理的細菌數目和多樣性指數明顯高于連作，細菌群落結構組成亦明顯不同。輪作處理中疣微菌門、酸桿菌門和浮霉菌門含量明顯升高。有研究表明，疣微菌門和酸桿菌門能有效分解有機物、提高植株抗逆能力[17]；浮霉菌門在植物營養成分的吸收，特別是碳源、氮源的利用方面具有重要作用[18]。另外，輪作使部分功能菌的 數 量 增 加 ，如 Planctomyces、Gemmata、Flavisoli?bacter、Luteolibacter等。Planctomyces可將多糖分解為小分子糖類被植物利用[19]；Gemmata能增加脲酶的活性[20]，脲酶是一種酰胺酶，可酶促分解有機物，脲酶活性升高能提高植物對有機物的利用率；Flavisoli?bacter能促進土壤磷素循環[21]；Luteolibacter參與植物對有機質的分解利用過程，對環境中碳循環有重要意義，還可能對某些植物真菌性病害有拮抗作用[22]。此外，Flavobacterium、Luteimonas含量在輪作組中明顯減少，而Flavobacterium可能和一些植物病害的發生有關，其豐度與谷子黑穗病的發病率呈正相關[23]，且在發病小麥的根際土壤中富集[24]。綜上表明，輪作使谷子根際土壤中細菌的群落結構發生變化，有益菌的數量明顯增加，有害菌的數量減少，對于促進營養成分吸收、提高有機質利用率、增強植株抗病性有重要意義，也是谷子增產的有利條件。

4 結論

幾種不同的輪作方式對土壤理化性質、酶活性和根際細菌多樣性等均產生影響，其中大豆-馬鈴薯-谷子輪作后谷子根際土壤細菌多樣性指數最高，土壤中富含 Planctomyces、Gemmata、Flavisolibacter、Luteoli?bacter等有益功能菌，具有更高的土壤養分和土壤酶活性，獲得較高谷子產量。綜上表明，利用大豆-馬鈴薯-谷子輪作有助于改善谷田生態環境，增強土壤肥力，促進谷子增產。