環狀RNA研究進展

李宏宇 許文濤，2

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

環狀RNA（circRNA）是在RNA成熟過程中一個叫反向剪接的環節中出現的。代替了傳統的線性連接方式由上游的5′端的結合位點與下游的3′端結合位點反向連接形成環狀。環狀RNA是一類特殊的內源性非編碼RNA，繼長鏈非編碼RNA和微小RNA之后的一類特殊群體，但是現在同樣有研究稱環狀RNA構成了一類有趣的長鏈非編碼RNA群體。雖然承認其在細胞內的存在性已經有30多年，但對其在細胞內的廣泛性和高豐度是直到21世紀初期才被逐漸發現。環狀RNA具有穩定的結構，可以不依靠蛋白單獨存在。環狀RNA作為一類特殊的RNA群體，由于其本身的環化結構而不帶有正常RNA的3′和5′端，不能通過傳統的檢測技術檢測而被忽略，直到新一代測序技術的出現和發展使其可以通過去除rRNA富集之后進行測序將它重新帶入科學家的視野中［1-4］。

環狀RNA由外顯子反向剪接形成的ecircRNA、內含子來源的inciRNA以及外顯子和內含子都參與的EIciRNA三大類組成。很多生物信息學的方法都證明了環狀RNA 的反向剪接方式，其標志性的剪切位點GT-AG成為檢測其存在的一個重要標志，從來源上講，其大部分來源于外顯子和內含子，但同樣也包含基因間的序列和非編碼的UTR區域；這些分析同時也表明不同的環狀RNA有可能來自于同一個基因座，同時出現一種替代環化的現象，這些環狀RNA序列長度在大到25 000 nt以上小到小于100 nt不等，已有研究證實在病毒和擬病毒中最小的環狀RNA為220 nt，同時其也是一個可以編碼16 kD長度蛋白的環狀RNA［1-3，5-6］。環狀RNA在很多發育過程中都起著重要的作用，如作為miRNA的海綿體，通過結合miRNA來調節miRNA 的表達；與U1SnRNP結合來促進基因的轉錄等。一些研究報道稱，環狀RNA在不同的組織和不同的發育時期的表達量不同。這意味著環狀RNA不僅是監管和拼接的副產品，同時也是在基因調控上有著重要作用的功能性基因［7］。與此同時，環狀RNA對多種疾病都存在著調節作用并且可以作為其中一些疾病的生物標記物。因此，環狀RNA的重要程度是不言而喻的。本文將對環狀RNA的形成機制、功能、尤其是檢測方法、novel 環狀RNA的鑒定以及疾病相關性一個認知程度內的概述。

1 環狀RNA的發現及存在物種

環狀RNA是一類由3′端反向與5′端連接形成的共價閉合環狀RNA分子，環狀RNA與microRNA以及長鏈非編碼RNA在轉錄的過程中占據了總RNA含量的95%左右。首次提出環狀RNA的概念是在1976年，Sange［8］和他的同事提出高等植物中的一種類病毒RNA為環狀，稱為環狀RNA。在1979年，在電子顯微鏡下發現了環狀RNA為其存在性提供了有力的證據［9］。1991年，Nigro等［10］在研究RNA翻譯表達的時候發現很多異常拼接的RNA分子，其中腫瘤抑制基因DCC在體外發生了異常拼接。在1993年，在動物的睪丸中發現性別決定基因sry是一種環狀RNA［11］。但是環狀RNA在從發現到被重視這30年間一直被視為RNA剪接成熟過程中的異常剪接物而被忽視，直到21世紀初隨著高通量測序技術的發展和深入，環狀RNA才重新走入科學家的視野。至今為止，隨著研究的深入，已經在線蟲、小鼠、大鼠、豬、猴子和人類等物種中發現了環狀RNA的存在。其中Jeck等［1］在人成纖維細胞中檢測到至少25 000種環狀RNA；Memczak等［12］在線蟲、小鼠和人體中分別找到了大約700種、1 900種和2 000種環狀RNA。未發現的環狀RNA仍有很多，同樣在其他物種中也必然存在豐富的環狀RNA，還有待進一步探究。

2 環狀RNA的形成機制及其生物學特征

2.1 環狀RNA的形成機制

環狀RNA是一類特殊的內源性非編碼RNA具有高豐度、高保守性及高度的組織特異性等特點。環狀RNA在哺乳動物的組織中是非常普遍的，并且可以通過和miRNA結合及其他的方式從轉錄和非轉錄的水平上調節基因的表達。環狀RNA具有重要的調節作用，但是在剛發現其存在的時候，其被視為一種前體RNA成熟剪接過程中的非功能性產物，本質原因即為其形成方式的獨特，并不是傳統的線性連接方式，而是一種特殊的剪接方式—反向剪接。其形成的環狀RNA的前體來源大體分為兩類，即外顯子和內含子。

2.1.1 外顯子環狀RNA的形成機制 第一例被發現的內源性產生的環狀RNA是20世紀90年代在一個對于人類細胞中DCC的轉錄研究中發現的。據這個實驗的研究者稱外顯子的轉錄方式超出了預期，下游的3′跳躍到了上游與5′端連接，盡管是這種不正常的連接方式，其所用的連接位點和接受位點與正常的連接方式是一樣的［13］。這種連接方式被稱為外顯子的“跳讀”［1］，由此外顯子的形成方式已逐漸清晰。后來根據Jeck等［3］的研究，總結出外顯子形成環狀RNA的兩種主流形式，第一種方式為直接反向剪接，由下游的3′端跳躍到上游與5′端結合形成環狀RNA，由于其過程中發生的反向拼接現象，其中間部分的內含子序列隨之一起折疊，并且在此過程中內含子與外顯子連接的3′以及5′端連接形成套索結構，并隨之被剪切去掉，剩下的外顯子部分反向連接形成環狀結構。第二種方式為內含子競爭性配對結合，此種方式中pri-mRNA兩端的內含子由于競爭性的互補配對促使外顯子發生反向折疊連接在一起，再將內含子部分剪切除去形成外顯子部分連接的環狀RNA，如圖1。已有研究證實直接反向剪接形成環狀RNA的效率要高于內含子競爭性配對方式形成環狀RNA，而且在機體內這種形成方式更為普遍［14］。外顯子形成的環狀RNA可以分為單個外顯子、2個及2個以上外顯子形成的環狀RNA幾種，根本在于其剪切位點的不同。環狀RNA在體外的轉錄合成已經得到了證實［15］。

2.1.2 內含子環狀RNA的形成機制 剪接在某種程度上就是intron splicing即內含子的剪接，而內含子的進化分類如果按剪接方式來分可以分為I類內含子、II類內含子（group I、II intron）和核mRNA前體內含子（Spliceosomal introns），其中核mRNA前體內含子（Splicesomal intron）對于外顯子形成的環狀RNA是密切相關的，而group I intron和group II intron代表了內含子環狀RNA形成的兩種不同驅動方式［16］。

2.1.2.1 I類內含子環狀RNA的形成方式 一個外源的鳥苷作為親核試劑去攻擊5′結合位點并與內含子結合，經酯基轉移后，5′端外顯子被切除并且外源的鳥嘌呤與內含子產生聯系，5′端外顯子的終端3′-OH攻擊3′端拼接點，連接的外顯子和一個線性的內含子被切除釋放。最終，由2′端羥基和5′端接受位點形成磷酸二酯鍵形成內含子環狀RNA［17］。

2.1.2.2 II類內含子環狀RNA的形成方式 環化的發生需要3′外顯子的提前釋放，內含子末端的2′羥基集團攻擊5′剪接位點，通過形成磷酸二酯鍵產生一個5′外顯子和一個環狀RNA，如圖2［18］。

2.1.3 環狀RNA形成的調節因素 據報道，環化的區域兩側必然存在著長度不一的重復側翼內含子序列，這是一種天然并且廣泛存在于細胞基因中的重復序列-Alu序列，其存在促進了環狀RNA的形成，Alu序列的作用受到藤黃節桿菌（Arthrobacter luteus，ALU）限制性酶的調控。同時，有相關研究報道還有一些其他內含子互補序列同樣對反向剪接起促進作用。除了一些內含子互補序列對反向剪接起促進作用之外，一些RNA結合蛋白如肌肉生長調節因子（Muscleblind，MBL）能夠促進環狀RNA的合成，可變剪切調節因子（Quaking，QKI）在上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程中可以調節環狀RNA的合成以及RNA結合調節蛋白（RNA binding motif protein 20，RBM20）同樣對環狀RNA的形成起調節作用［19］。

2.2 環狀RNA的生物學特征

生物學特性一般是指形態、大小、結構、顏色等理化性質，而環狀RNA的生物學特性是對其種類、分布、豐度等性質的概括。由于環狀RNA反向剪接而成的特征，其存在很多獨特的生物學特性。

環狀RNA種類繁多，能夠由一個外顯子或者許多個外顯子構成，環形的長度從小于100 nt到大于4 000 bp不等［3，20］。存在范圍非常廣泛，在鼠類中已經發現近2 000種環狀RNA，在線蟲中發現超過700種。它在不同物種間有很好的保守性，有趣的是，已經證實69種環狀RNA在人類與鼠類之間有著精準的保守性。環狀RNA的表達量是非常少的，但是其在細胞中的豐度非常高。

3 環狀RNA的功能

3.1 作為microRNA的海綿體

圖1 外顯子環狀RNA的形成

圖2 內含子環狀RNA的形成

MicroRNA作為非編碼小RNA家族中的一員，其在基因表達的調控方面具有至關重要的作用。而研究發現環狀RNA通過其具有microRNA海綿體的作用，可以通過與microRNA的結合來調控microRNA的作用以此間接調控著很多的生理狀態。

3.1.1 ciRS-7 在環狀RNA研究中，對microRNA的研究最多的就是miR-7，它對其他癌癥和疾病中的很多相關因素都具有調節的功能，如細胞發育、增殖和細胞凋亡［21-22］。在對許多惡性腫瘤研究發現，它能作為很多組織的癌癥和腫瘤的抑制基因，包括乳房［23］、大腦［24］、頭部和頸部［25］、肝臟［26］和肺［27］。小腦的退化相關蛋白1的反義鏈（CDR1as），亦稱為miR-7海綿體，能夠與micror-7結合并調節其功能，這提供了第一個環狀RNA可以作為microRNA的海綿體的證據［28］。CiRS-7包含了70多個對mir-7的結合位點，并通過Argonaute蛋白質緊密聯系在一起［29］。通過延伸和附近結合效應，這種環狀RNA對不同的miRNA分別有一個單獨的結合靶位點。而miR-671可以分裂ciRS-7/CDR1as來調節環狀RNA對miR-7的抑制作用［30］。已有研究證明了環狀RNA中ciRS-7/CRR1as的保守性和穩定性以及對miR-7活性的調節作用。通過與miRNA結合形成復合體以及重新釋放它們來調節其活性，這是對miRNA活性研究的新發現。盡管這種競爭性內源RNA的想法并不新穎，并且飽含爭議，但是環狀RNA的穩定性足以支撐起其海綿效應的其余優勢了。

3.1.2 Sry circRNA 成熟的哺乳動物性別決定基因（Sex-determining region Y，Sry），能夠形成一種特殊的環狀序列［28］。這個長度在1.2kb的完全由外顯子組成的環狀RNA包含了16個miR-138的靶位點，也能起到類似于miRNA海綿體的作用。盡管這種作用和環狀RNA ciRS-7/CDR1as的作用類型相似，都是競爭性內源RNA的方式，但是這種機制是建立在特殊的RNA序列和重復序列上的［31］。因此，這種機制是否是普遍存在的環狀RNA調節機制還有待進一步的研究。

3.1.3 circHIPK3 Zheng等［32］的進一步研究發現了一種環狀RNA circHIPK3，這是一種來自于HIPK3基因外顯子的環狀RNA。體外研究顯示，在癌細胞中沉默circHIPK3導致癌細胞的增長速度顯著下降。通過熒光素酶報告基因的篩選，他們觀察到circHIPK3可以結合多種microRNA，包括眾所周知的腫瘤抑制因子miR-124［33］。這說明circHIPK3通過在人類細胞中調控多種microRNA來調節細胞的生長。

3.1.4 cirITCH 最近發現的一種叫做cirITCH的環狀RNA，同樣有miRNA海綿的作用，通過調控mir-7和mir-20a來發揮作用。它增加了ITCH的表達水平，這是一種蛋白質編碼基因，它會引發泛素介導的Dvl2退化并抑制常規的Wnt信號通路，具有整體的抗腫瘤效果［34］。

3.2 環狀RNA的產生具有調節可變剪接的作用

環狀RNA的產生對可變剪接的調節作用幾乎是已經確定的了。這種機制基于一個事實：pre-mRNA的剪接過程主要是3′端和5′端的競爭性結合［35］，而在這個過程中一旦出現反向剪接現象，外顯子將會出現“跳讀”現象，這將使原本pre-mRNA的正常剪接過程發生變化，或者導致其被降解。在這種案例中，環狀RNA的產生對于調節pre-mRNA的可變剪接過程有著重要的作用，盡管這將導致環狀RNAs有可能失去功能性。同時反向剪接與正常的RNA剪接成熟在pre-mRNA的后加工過程中是存在競爭性的，環狀RNA的產生意味著正常線性RNA的產量變少。

3.3 環狀RNA的其他的一些可能性的功能

很多不同的關于環狀RNA的功能已經被發掘出來［36］，包括其他影響因素的海綿體，例如RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RNPs）。環狀RNAs能夠通過結合和分離這些影響因素從而阻止它們發揮作用。在這方面強有力的證據就是其上含有的結合位點，如miR-7和ciRS-7/CDR1as的關系。然而由于大多數環狀RNA的低含量，其持續影響目標分子的能力勢必會大幅度降低［37］。

環狀RNA可以作為一些混合物的“儲藏室”，并且可以轉移這些因素去一些特別的亞細胞位置，或者可以作為某些反應的支架。盡管環狀RNA有起始密碼子和合理的開放性閱讀框，并且在一些功能性環狀RNA上已經發生了翻譯現象，如IRESes。但是其翻譯性現階段只在病毒中被證實了而在真核生物中還沒有確實的答案，關于其翻譯的證據到現在為止還是十分缺乏的

4 環狀RNA的檢測方法

在1976年首次提出環狀RNA的概念，1979年在顯微鏡下發現了類病毒中的環狀RNA，1982-1988年研究者們用瓊脂糖凝膠電泳和2D凝膠電泳中都檢測到了環狀RNA的存在，測序技術的發展使環狀的檢測變得越來越容易，從只能知道其存在到能確定是何種環狀RNA，環狀RNA的檢測經歷了長足的進步史。

4.1 分子生物學方法

用northblot分離環狀RNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，雖然環狀RNA的遷移速率要比線性RNA的速率慢很多，但是實際上外顯子環狀RNA相比于其他來自于同一基因的全長線性RNA以及含有重復外顯子序列的線性RNA所含有的核算數量要少的多，所以其在瓊脂糖中的遷移速度反而要更快一些［38］。更具有決定性意義的實驗是使用弱水或者靶向RNaseH進行降解處理，在瓊脂糖凝膠電泳中未被處理的RNA遷移速率最慢，而被處理的線性RNA會出現兩條條帶，但是被處理后的環狀RNA只有一條條帶［11］。同時還可以用2D凝膠電泳，在此凝膠中線性RNA會跑出一條對角的直線，而環狀RNA則是從斜對角一端到另一端的拋物曲線［30，39］。但一種方法的檢測必然存在不精準的地方，需要多種方法協同使用才能達到最佳效果。

環狀RNA同樣可以定量檢測，環狀RNA的pcr與普通的線性基因pcr不同，因為環狀RNA在premRNA的剪切過程中為反向剪接，其下游的3′位點與上游的5′位點結合導致其引物不是常規上游下游各一段引物相向擴增就可以得到結果，其junction位點處與線性RNA不同。但是其序列body處的堿基排列還是一致的，所以需要設計一種背對背引物（Divergent primer），可以反向擴增來實現環狀RNA的定量驗證。這種背對背引物的設計在環狀RNA的數據庫網站上有專門的設計專欄，如圖3［40-41］。

4.2 建庫測序檢測

4.2.1 環狀RNA單組學建庫 環狀RNA單獨建庫，其最關鍵的步驟在于去掉線性RNA及rRNA，單獨留下環狀RNA進行后續建庫。

首先分離mRNA，通過磁珠法，利用磁珠上結合的oligo dT捕獲帶有poly A尾的mRNA，此時未與磁珠結合的環狀RNA存在于緩沖體系中，收集上清，通過乙醇沉淀的方法，得到去除mRNA后的RNA，而磁珠捕獲的mRNA可以用來構建轉錄組文庫，為了后續與環狀RNA信息進行聯合分析。

下一步需要去除核糖體rRNA及其他線性RNA。首先采用rRNA清除試劑盒，用單鏈DNA探針ssDNA probe特異性的雜交rRNA，形成DNARNA雙鏈產物，用RNase H對其進行降解，之后用DNase I降解探針，再用RNase R進一步降解線性RNA，乙醇沉淀得到最終的環狀RNA。

最后通過片段化、反轉錄、尾端修復、加接頭及PCR擴增等常規建庫流程得到最終的環狀RNA文庫，采用PE150測序策略，一般5 G的數據量就可以達到分析要求。

4.2.2 全轉錄組建庫 全轉錄組包括mRNA、環狀RNA、lncRNA等RNA的全部信息，其建庫策略為只去除核糖體rRNA，不去除其余的線性RNA，通過構建一個全轉錄組文庫，結合不同生物信息學的分析方法來獲得全部的轉錄信息，并最終進行聯合分析。

全轉錄組建庫的關鍵在于去除核糖體rRNA，其大部分環節與環狀RNA單組學建庫是一致的，都是通過探針雜交并特異性酶解法去除DNA-RNA結構上的rRNA，并進行后續建庫。測序策略仍為PE150，數據量要求10 G以上。

4.3 測序相關的檢測算法

在過去的20年里，人們對于環狀RNA的研究已經取得了巨大的進步，但是起初對于環狀RNA的忽視主要源于對其的檢測技術不完整，并且沒有特異性、有效的環狀RNA序列信息，因此在檢測技術不斷發展的過程中出現了大量不同的檢測算法。

2012年，Salzman等［2］提出了一種依賴于基因注釋的算法，在這種算法中環狀RNA能在已經比對基因組且進行外顯子邊界注釋的標準數據庫的基礎上被檢測出來，并且通過增加錯誤發現率（False discovery rate，FDR）的方法篩選出質量最優的比對片段來提升這種算法的準確率［20］。然而他們的算法主要依賴于已經注釋的基因，對于那些還沒有完全注釋的基因不能精確的檢測；并且這種建立在數據基礎上的篩選有可能對那些低覆蓋率的測序區域或者測序深度不夠的區域起不到最好的檢測效果。Memczak等［12］提出了利用GT-AG這段真核生物中特有的前體RNA剪切過程中的保守位點為信號來篩選出一些新的環狀RNA；也有一些相似的算法用于尋找有miRNA海綿體功能的環狀RNA［42］。但這些算法均采用了兩部分序列比對的方式，這可能導致某些不具有此特征的環狀RNA未被篩選出來，且這些算法在剔除假陽性方面可能無效。

Jeck等［1］采用了另外一種方式，比較RNase處理過和未處理的序列篩選出環狀RNA的候選序列，并且剔除假陽性。這種方法對于環狀RNA的檢測更加敏感，并且能估算環狀RNA的相對含量；然而這種方法在富集的過程中可能出現偏差，并且富集的過程是必不可少的。相較于環狀RNA檢測算法，序列比對算法發展歷史久遠，并且一些是被特定設計用于局部和分裂位點比對的。BWA-MEM利用空位延伸模型提出了一種可以提供最大準確率的局部比對位點，更加高效準確的算法。

Segemehl［43］用一種加強的后綴陣列針對保守位點檢測的算法，且比其競爭對手在檢測剪切位點上有更高的準確率。此后，Gao又提出了一種用sam格式中的CIGAR值進行分析，從sam文件中掃描PCC信號（paired chiastic clipping signals）。對于splicing信號（GT，AG）比較弱的，算法會從文件中抽取外顯子邊界位置，并用已知的邊界來過濾假陽性。因為環狀RNAs是環狀拼接模式，在其拼接的過程中會出現不同的比對結果，這些成熟的比對算法有可能使環狀RNA的檢測有更高的準確率和效率，而如果沒有這些算法，則假陽性的出現是不可避免的。

5 Novel環狀RNA的鑒定及驗證

通過上述分子生物學與生物信息學以及不同檢測算法的結合，我們能夠得到準確率很高的環狀RNA，這些環狀RNA可以通過查找環狀RNA數據庫來確定其是否為新的環狀RNA。例如，環狀RNABase、deepBase、circBase、Circ2Traits等數據庫。這些數據庫中包含序列的查找，編號的確定以及引物的設計多種功能。確定其為新的環狀RNA之后要對其功能進行實際驗證。

圖3 環狀RNA檢測圖

5.1 環狀RNA功能及活性的驗證

由于環狀RNA較多情況下作為miRNA海綿體存在，可以采取AGO2免疫沉淀法分析環狀RNA結合的miRNA。環狀RNA本身結合著大量的AGO2蛋白，并且可以通過RIP確認。將環狀RNA序列插入到螢火蟲熒光素酶報道基因下游，通過環狀RNA在結合miRNA后能夠產生脫腺苷化，從而產生降解活性，抑制LUC酶活。并以此來判斷環狀RNA與哪些miRNA發生作用，進而對miRNA進行富集，通過miRNA靶基因預測來尋找其下游轉錄基因，并進行pcr和western blot驗證基因的表達量以及蛋白的活性的變化，以此來判斷環狀RNA的功能。

鑒定環狀結合的具體的miRNA，可以構建螢火蟲熒光素酶的miRNA篩選文庫。每個miRNA都和螢火蟲熒光素酶報道基因一同轉染進入細胞中。從而可以確定具體是哪些miRNA發生作用，并進行下一步驗證。

5.2 環狀RNA驗證方法

5.2.1 環狀RNA的Northern blot驗證 Northern blot是一種很傳統的驗證基因的手段，通過瓊脂糖凝膠電泳針對特定的基因設計它的探針來檢測其存在性，但是環狀RNA的特殊性決定了其探針的設計不同于普通線性RNA。對于外顯子環化環狀RNA，建議探針盡可能跨backsplice junction位點；對內含子環化環狀RNA，可圍繞內含子區域設計探針。

5.2.2 環狀RNA的過表達驗證 過表達驗證在基因功能的驗證是一種很流行的方法，環狀RNA過表達思想主要源于環狀RNA生物形成機制，已有多篇文章報道環狀RNA成環機制，目前比較公認的成環機制為環狀RNA側翼序列的堿基互補配對，稱之為Alu結構。基于環狀RNA側翼Alu序列特征，PCR擴增含側翼Alu序列的目標DNA序列，隨后依據對應限制性內切酶位點進行酶切，進而連接pEGFP-C1載體。連接載體進而轉染對應細胞樣本，定量PCR檢測轉染效率［44］。基于divergent primer驗證環狀RNA 過表達倍數［45］。

過表達策略：（1）擴增目標區域包含環狀RNA側翼Alu序列或內部堿基互補序列，側翼上下游1kb處過表達效率更佳；（2）目標區域擴增基于基因組DNA為模版。

5.2.3 環狀RNA的敲除 環狀RNA敲除思路主要針對環狀RNA反向剪接接口處序列信息設計siRNA，對于內含子環化環狀RNA，也可針對內含子區域設計相應siRNA進行干擾。背對背引物驗證環狀RNA敲除倍數。

敲除策略：（1）外顯子環化環狀RNA，針對反向剪接連接位點前后序列設計siRNA。（2）內含子環化環狀RNA，除針對反向剪接連接位點前后序列設計siRNA序列以外，也可針對內含（3）子區域序列設計siRNA。每個siRNA設計對應的對照，反向剪接連接位點一端互補配對，另一端錯配。

6 環狀RNA與疾病的相關性

6.1 環狀RNA與疾病的相關性

6.1.1 環狀RNA與心血管疾病的關系 缺血性心臟病是發達國家致死率和發病率居高不下的疾病之一。第一個被驗證的環狀RNA cANRIL，其與單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）關系密切，有猜測這些改變了cANRIL的剪切拼接過程導致INK4A/ARF位點的表達，從而使動脈粥樣硬化的發病率增高［5］。同時缺氧也是致使動脈粥樣硬化發病的關鍵因素之一，而此因素同樣受到環狀RNA的調控［46］。Greene 等［47］也表明環狀 RNA cZNF292是受到內皮細胞缺氧因素的調控并控制血管的生成，環狀RNA在人類心臟組織中高度表達，與關鍵心臟基因TTN、RYR2、DMD都有聯系。

6.1.2 環狀RNA與阿耳滋海默氏病的關系 最初的研究表明環狀RNA在腦組織中的表達量很高［32］，并且有可能參與到突觸功能和神經可塑性的調控當中［48］。Lukiw等［49］的研究支持了這種說法，他們發現了老年癡呆癥（AD）患者大腦的海馬區是錯誤調控的，患者的海馬區的miR-7/ciRS-7調控系統是錯亂的，miR-7的上調導致了ciRS-7的缺失以及其它一些與此AD疾病相關的靶基因表達量的下調，包括泛素接合酶（UBE2A）蛋白。UBE2A是泛素循環中的一個重要因素，它通過吞噬作用幫助清除淀粉樣肽。它在AD患者大腦中的缺失會導致淀粉狀蛋白的生成，促使阿耳滋海默氏病即老年癡呆癥發病。

6.1.3 環狀RNA與糖尿病的關系 糖尿病是長期不健康的生活狀態造成的后果，早期檢測和更好的治療方法是必要的。Xu等［50］的研究表示過表達miR-7基因的轉基因小鼠β細胞導致糖尿病的發生。同時該研究也表明過表達ciRS-7會抑制miR-7功能，進而改善胰島素分泌。MiR-7的潛在靶基因已通過生物信息學分析確定，包括Myrip（調節胰島素分泌顆粒基因）和Pax6（增強胰島素轉錄基因）。

6.2 環狀RNA與癌癥的關系

6.2.1 環狀RNA與胃癌的關系 盡管許多發達國家胃癌的發病率顯著下降，但胃癌仍是世界癌癥中死亡率最高的疾病之一。Li等［51］的研究已經確定了環狀RNA hascirc002059是一種與胃癌有關的環狀RNA。其發現與健康對照組相比，患者的胃組織中此環狀RNA的表達量是下調的。此外，在胃癌患者的血漿樣本中發現了hsacirc002059，與健康對照組相比，其含量明顯降低。類似地，Chen等［52］的研究已經確定了circPVT在胃癌組織中被上調，并通過調控miR-125家族的成員來促進細胞增殖。

6.2.2 環狀RNA與膀胱癌的關系 膀胱癌起源于膀胱的上皮內層，是全球排在第9位的最常見的癌癥之一。在膀胱癌中，使用高通量微陣列技術同樣發現了環狀 RNA［53］。通過這種方法，Zhong等［53］的研究發現與鄰近的非腫瘤組織相比，在膀胱癌發現2種下調的環狀RNA circFAM169A，circTRIM24和4個明顯被上調的環狀RNA circTCF25、circZFR、circPTK2和circBC048201。此外，在癌組織中，circTCF25可以通過調節miR-103a-3p和miR-107，從而提高CDK6基因的表達。這與癌癥的發展密切相關。

6.2.3 環狀RNA與肝細胞癌的相關性 肝細胞癌（HCC）是肝臟疾病中的一種主要的惡性腫瘤，有慢性肝病和肝硬化的患者患病率居高。Zheng等［32］的研究表明與正常組織相比，在HCC中發現的環狀RNA出現異常表達的現象。Qin等［54］在HCC中發現了hsacir0001649，并發現與相鄰的正常肝組織相比，這一環狀RNA的表達明顯下降。與此形成對照的是，Shang等［55］已經確定了另一種環狀RNA hsacir0005075，與正常組織相比在HCC中其表達量是明顯下調的。與此類似，Yu等［56］在HCC中檢測了先前發現的ciRS-7，發現它的表達在HCC腫瘤組織中與鄰近的非腫瘤組織相比是顯著下調的。由于ciRS-7對mir-7有海綿作用，進一步的驗證中包括對ciRS-7的敲除和mir-7的過度表達，發現ciRS-7作為一種致癌基因，一定程度上是通過對miR-7的調控來影響HCC進行的。

7 展望

迄今為止，我們所知道的環狀RNA的種類以及功能仍然只占總環狀RNA的一小部分，還有很多環狀RNA待人們去發掘，環狀RNA作為一類有調節功能的RNA，其在對人體研究中必然占據重要位置。高效快捷準確的檢測及鑒定技術將成為重點發展的領域，從RNA序列數據庫中對環狀RNA進行預測及鑒定首先是要了解和抓住環狀RNA在細胞中廣泛存在的特點；其次在各種檢測技術和算法中去除假陽性以及對環狀RNA的富集是關鍵。環狀RNA具有穩定的結構和高度的保守性，這些都是其能在不同的生物中發揮重要作用的依據，而除了miRNA海綿體、調節基因表達以及與RNA蛋白結合等作用外，其還有一些未證實的作用需要人們繼續對環狀RNA的功能進行更全面和廣泛的鑒定。也因為環狀RNA的高度保守性以及穩定性使其能夠成為癌癥的典型標志物，現階段發現的環狀RNA都是可以不依賴蛋白獨立存在的，環狀結構使其不容易被RNA酶類降解，所以只在某些特定癌癥中存在的環狀RNA的表達量變化將直觀體現出一些特定癌癥的變化情況，可以作為癌癥的標志物，能夠用于如肝細胞癌、乳腺癌、胃癌等一些特定癌癥的診斷標志物，以及早期預防和后期治療的有效手段，通過過表達或者抑制特定環狀RNA可以達到抑制癌癥的惡化的目的，而對于環狀RNA的快速檢測以及特定癌癥環狀RNA作用的探索將因此成為一個重要的研究方向；隨著單細胞環狀RNA測序技術的逐漸完善，可以從單細胞層面了解不同細胞間環狀RNA的區別，有些環狀RNA只在某些特定的細胞中存在，因此環狀RNA同樣可以作為標志物來區分同一組織不同區域的細胞；同時環狀RNA無論是作為miRNA海綿體對基因表達的調控，還是其反向剪切的方式與正常線性RNA生成的剪切方式存在競爭關系，其都有調控生命進程的作用，環狀RNA可以作為調控細胞生存狀態的關鍵物質。因此，對于環狀RNA自身結構功能性以及其轉錄過程中競爭性機制的研究也將成為重要議題。

同時環狀RNA的研究還存在著很多問題需要解決。環狀RNA的具體合成機制，其合成過程中涉及到的酶及剪切過程等詳細環節需要研究完善；環狀RNA參與生長發育過程中的許多環節，但是環狀RNA的移動觸發信號還不是很清楚；環狀RNA可以作為miRNA的海綿體，但是其無論與一個miRNA反應還是多個miRNA反應，以及miRNA、環狀RNA、目的基因之間的具體調控機制需要進一步完善；如何預測環狀RNA的三級結構以及它們之間的相互作用需要更系統的探討。這些都預示著環狀RNA在將來很長一段時間里都會是研究的重點。