畜禽PPARα基因研究進展

王朝陽 藍立明 白丁平 張福君 李昂

（1. 福建農林大學，福州 350002；2. 吉林正方農牧有限公司，梅河口 135000）

在畜禽生產上，脂質代謝一直備受關注，肝臟作為機體脂類代謝的最大器官，探究其脂質代謝機制一直為研究熱點，在水禽通過超飼生產肥肝等研究中更是重中之重。在肝臟脂質代謝的調控網絡中，過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是其中一個關鍵樞紐［1］。PPARs是一類需要配體激活的核轉錄因子，屬于核受體超家族（Nuclear-hormone receptor superfamily，NR），目前已知有 PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三種亞型［2-4］，在動物機體能量代謝過程中均發揮重要作用［5-6］。PPARα自19世紀末被發現以來，其在脂類代謝中的作用機制一直備受關注，PPARα基因在動物肝臟中廣泛控制著與游離脂肪酸轉運和β-氧化有關聯的蛋白質的表達，在脂類代謝和維持葡萄糖穩態方面具有重要意義［7］。

1 PPARα結構特點及作用機理

1.1 PPARα基因和蛋白的結構特點

不同物種的PPARα基因結構有明顯差異。鴨的PPARα基因cDNA 全長1 430 bp，最長開放閱讀框為1 407 bp，可編碼468個氨基酸［8］。山羊PPARα基因CDS區全長1 413 bp，結構穩定，共編碼470個氨基酸［9］。豬PPARα基因全長1 488 bp，可編碼468個氨基酸［10］。藏雞PPARα基因序列1 430 bp，開放閱讀框1 404 bp，也可編碼468個氨基酸［11］。而人類PPARα（NR1C1）基因位于第22號染色體22q12-q13.1位置，跨度大約93.2 kb堿基，同山羊、蔵雞等一樣，人類PPARα基因也可編碼468個氨基酸［12］。小鼠PPARα基因位于15E2染色體，也可編碼包括468個氨基酸的蛋白［2］，其PPARα基因轉錄的mRNA均有8個外顯子編碼，包括外顯子1，2和部分外顯子3編碼的5′非編碼區，外顯子3其余部分和外顯子4-8編碼的PPARα編碼區［13］，外顯子8最后232 bp堿基編碼PPARα基因的3′端非編碼區［14］。

PPARα蛋白結構特點同NR其他成員相似，由A/B、C、D和E/F幾個結構域組成［15］，如圖1所示。A/B域位于PPARα蛋白N末端，該區域包含激活功能區，其轉錄因子活性低且不受配體約束，可通過磷酸化作用及與其他結構域互作調節PPARα功能，其基因轉錄特異性由受體中A/B結構域的功能特異性序列決定［16］。C結構域為DNA結合區（DNA-binding domain，DBD），之后為柔性鉸鏈區（Hinge）即結構域D，其連接著DBD區和配體結合區E（Ligandbinding domain，LBD）。D結構域上的柔性鉸鏈區可識別輔抑制蛋白即阻遏蛋白上的阻遏功能域，并與其結合，在輔抑制區與輔激活區有部分重疊，能夠使PPARα、DNA、配體及蛋白質相互結合［17］。

鴨PPARα蛋白中α-螺旋較多，該蛋白質含有1段短的核定位信號序列KKNRNKC，在引導蛋白質進入細胞核過程中發揮作用，同時還有2個鋅指結構組成的DBD區及1段LBD區。山羊PPARα蛋白是一種結構較為穩定的帶負電的親水性蛋白，以α-螺旋和無規則卷曲為主，無信號肽和跨膜蛋白，屬于膜內蛋白，其蛋白序列中總共有49個磷酸化位點，9個糖基化位點。蛋白結構高度保守，保守結構域中含有明顯的DBD區域和LBD區域。三級結構預測其蛋白主要為通過長鏈卷曲連接的2個結構區域，且均以helix-螺旋結構為主。藏雞PPARα蛋白為不穩定酸性蛋白，存在27個磷酸化位點和4個糖基化位點，無信號肽和跨膜螺旋結構，其二級結構預測中α-螺旋占37.61%，β-折疊占16.67%，無規則卷曲比例占45.73%。

圖1 PPARα蛋白結構示意圖

1.2 PPARα配體分類及其表達模式

PPARα作為細胞核受體，能夠與特異性配體結合并被激活，進而啟動PPARα信號通路，發揮其信號轉導途徑的調控功能。其激動劑可以分為外源性配體和內源性配體兩大類。外源性配體是合成化合物，又稱過氧化物酶體增殖子（Peroxisome proliferators，PPs），內源性配體是生物分子類，為機體本身大分子物質或代謝生成的小分子中間產物，兩者在PPARα表達中均發揮重要作用。

1.2.1 PPARα外源性配體 PPs包括安妥明、非諾貝特、納非烯、環丙貝特、Wy-14 643（哌啶酸）等降血脂藥物［18］，以及增塑劑鄰酞酸二辛酯（Diethylhexyl phthalate，DEHP）、己二酸二辛酯［Di（2-ethylhexyl）adipate，DEHA］等工業試劑，另外某些食品調味劑、除草劑、殺蟲劑和白三烯D4受體拮抗劑等也可作為PPARα配體［19］。Wy-14 643作為PPARα的外源性配體，具有良好的降血脂作用，有研究表明，經Wy-14 643處理過的鼠，其肝臟內脂質代謝重要途徑β-氧化及ω-氧化的相關氧化代謝酶活性升高，過氧化物酶體數量增多體積增大，肝臟內脂肪酸氧化活動增強，而過氧化物酶體增殖及β-氧化代謝酶活性升高，又可引發DNA損傷，進而改變細胞增殖周期，誘導細胞凋亡［20］。其他外源性配體雖然結構各異，但其對鼠肝臟脂代謝作用機制跟Wy-14 643基本相同。

1.2.2 PPARα內源性配體 充當PPARα配體的內源性分子包括脂肪酸及脂肪酸衍生物。PPARα大多數內源性配體已通過體外方法鑒定，膳食飽和脂肪酸（Saturated fatty acids，SFA）和不飽和脂肪酸（Unsaturated fatty acids，UFA）都可作PPARα直接配體，動物機體內脂肪酸分解和新脂肪酸合成過程中生成的某些中間產物可作為PPARα最終配體［21］，此外，機體內某些酶如8-、12-、15-和5-脂肪氧合酶（Lipoxygenases，LO），環氧合酶（Cyclooxygenases，COX），細胞色素 P450（Cytochrome P450，CYP450）以脂肪酸為底物生成的物質也可作為PPARα配體［22-24］。盡管動物機體內有許多合成配體能有效激活PPARα，但PPARα幾乎主要起脂質感應作用以調節機體能量燃燒［25-26］。有研究表明，PPARα能感知某些內源性脂質代謝中間產物作為配體，并通過誘導下游脂質代謝相關基因參與其運作，脂肪酰基輔酶A氧化酶1（Acyl-CoA oxidase1，Acox1）是脂肪酸β-氧化體系的第一個酶，也是限速酶，Fransen和Yeldandi等［27-28］通過敲除小鼠體內Acox1基因探究激活PPARα對肝臟代謝作用的影響。結果表明，小鼠缺乏Acox1后肝細胞內極長鏈脂肪酸在積累，且極長鏈脂酰輔酶A因缺乏Acox1不能進入脂肪酸氧化途徑，其未代謝底物便可作為內源性配體激活PPARα。此外，通過小鼠基因敲除實驗證明，烯酰輔酶A水合酶/ L-3-羥酰基輔酶A脫氫酶（Enoyl-CoA hydratase/L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，L-PBE/MFP1），D-3-羥基酰基輔酶A脫水酶/ D-3-羥基酰基輔酶A脫氫酶（D-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，D-PBE/MFP2） 和甾醇載體蛋白x（Sterol carrier protein x，SCPx）是降解PPARα內源性配體所必須的［29-33］，而其他如脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，FAS），脂肪乙酰輔酶A合成酶（Fatty acyl-CoA synthetase，FACS）和某些LO是生成PPARα配體所必須的［34-37］。

1.2.3 PPARα表達模式 同NR家族許多非類固醇成員一樣，PPARα可與另一種核受體類視黃醇X受體（Retinoid X receptor，RXR）組成異源二聚體［38］。如圖2，PPARα/RXR異二聚體可與靶基因啟動子上游的PPRE反應元件（PPRE：AGGTCA N AGGTCA，N可是任意一個核苷酸）結合，調節其基因表達［39］。PPARα/RXR異二聚體不受PPARα配體約束，可募集共抑制因子復合物如核共抑制劑（N-CoR）并抑制靶基因轉錄［40］。在細胞質中被配體激活后，共抑制因子復合物從PPARα/RXR異二聚體釋放，而共激活劑復合物如類固醇受體共激活因子-1（Steroid receptor coactivator-1，SRC-1）將被募集到靶基因啟動子區以啟動轉錄［41］。

圖2 PPARα表達模式示意圖

2 PPARα基因對肝臟脂代謝的調控機制

肝臟作為機體最大的能量代謝器官，可以協調脂肪酸和葡萄糖代謝，是全身能量穩態的中心參與者。肝臟內脂肪代謝主要包括脂肪生成、脂肪酸氧化代謝和脂質分泌3個方面［42］。核受體PPARs家族的3個亞型雖已被證明均可參與肝臟的脂質代謝過程，但PPARγ主要調節肝臟脂質合成，而PPARα主要功能為調節肝臟脂肪酸氧化代謝和能量消耗［43-45］。在動物肝臟內，PPARα主要通過被PPs、SFA、UFA及其衍生物即不同特異性配體激活，從而介導其靶基因調節脂肪酸合成代謝［46-47］，對動物肝臟脂肪代謝乃至整個機體脂肪酸穩態具有重要意義。

2.1 PPARα基因影響肝臟脂肪合成

肝臟內的脂肪生成主要包括新生脂肪酸合成和將新生脂肪酸轉化為甘油三酯兩個過程。在肝臟內，脂肪生成受轉錄因子固醇元件結合蛋白（Sterol regulatory element-binding protein，SREBP-1c）， 碳水化合物反應元件結合蛋白（Carbohydrate responseelement binding protein，ChREBP）和PPARγ共同調控［48-51］。其中SREBP-1c可調節糖酵解和脂質生成基因表達，如硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl CoA desaturase，Scd-1）和FAS，進而調控肝臟內脂肪生成過程［52］。

研究表明，PPARα可通過調節初級轉錄因子SREBP-1c和肝 X 受體 α（Liver X receptor α，LXRα）來增加Scd-1和其他脂肪生成基因的轉錄從而影響脂肪生成。通過敲除小鼠體內PPARα基因發現，LXRα非甾體配體合成可有效誘導脂肪生成基因，證明PPARα可參與內源性LXRα配體生成［52］。PPARα在肝臟合成脂肪過程中的作用雖然不大，但其轉錄因子在脂肪酸氧化代謝過程中的調控作用似乎自相矛盾，推測PPARα參與脂肪生成可能是處于某種故障-安全補償機制。

2.2 PPARα基因調控肝臟脂肪酸氧化代謝

肝臟在脂肪酸氧化中起重要作用，其脂肪酸氧化過程受PPARα調控［53］。肝臟內脂肪酸氧化過程主要發生3個亞細胞器中，大部分β-氧化在線粒體和過氧化物酶體內進行，而由CYP4A催化的ω-氧化發生在內質網［54］。這三條脂肪酸氧化代謝通路中的一些關鍵酶均具有PPRE元件，且主要受PPARα調控。另外，PPARβ/δ也可以參與調控一些酶活性［55］。

線粒體β-氧化主要參與短鏈（＜C8），中鏈（C8-C12）和長鏈（C12-C20）脂肪酸的氧化過程，可使脂肪酸轉變成酮體進而作為肝外組織的能量氧化底物，也可在饑餓期間進入三羧酸循環以進一步氧化成水和二氧化碳，是脂肪酸生成能量的主要來源［53］。脂肪酸在氧化之前需轉化為酰基輔酶A，線粒體β-氧化的第一步是脂肪酰基輔酶A酯通過直鏈酰基輔酶A脫氫酶家族進行α-β-脫氫；第二、第三和第四步主要有2-烯酰輔酶A水合酶、3-羥酰輔酶A脫氫酶和3-酮酰輔酶A硫解酶（Peroxisomal thiolase，PTL）活性的異源三聚體蛋白參與［25］。PPARα可調節長鏈酰基輔酶A合成酶（Long chainacyl-CoA synthetases，ACSL）和肉毒堿棕櫚酰轉移酶1（Carnitine palmitoyltransferase-1，CPT1），對于產生脂肪酰基輔酶A和促進脂肪酰肉毒堿進入線粒體至關重要［56］。此外，PPARα基因作為核受體，可通過脂質家族成員Lipin1的編碼轉錄激活，并通過與Lipin1和PPARγ輔助激活因子-1α（PGC-1α）的直接協同相互作用激活參與線粒體脂肪酸氧化代謝的許多基因的表達［57］。PGC-1α-PPARα 回路可在 Lipin-1誘導型共激活因子的作用下，增加參與脂肪酸β-氧化，TCA循環和線粒體呼吸鏈的基因的表達［58］。

過氧化物酶體β-氧化是流線型朝向代謝，可參與極長鏈脂肪酸（＞C20），2-甲基支鏈脂肪酸，前列腺素類化合物，二元羧酸和C27膽汁酸的中間體二羥基甾醇酸和三羥基甾醇酸的氧化代謝［59-60］。過氧化物酶體β-氧化的底物不夠豐富且毒性相對較大，并且它們不能被線粒體β-氧化系統處理，然而，過氧化物酶體β-氧化可縮短極長鏈脂肪酸鏈長，鏈縮短的酰基輔酶A可被分流到線粒體完成β-氧化。過氧化物酶體β-氧化有誘導型和非誘導型兩種，已有研究證明過氧化物酶體增殖物在過氧化物酶體系β-氧化系統中的協同誘導作用受PPARα調控［61］。在PPARα調控誘導型過氧化物酶體β-氧化途徑中，ACOX1將極長鏈脂肪酰基輔酶A分解為相應的反式-2-烯酰輔酶A為第一反應、第二反應和第三反應中，L- PBE / MFP1經過水合脫氫反應生成酮脂酰輔酶A，再由PTL轉化為乙酰輔酶A，成為比原始分子短兩個碳原子的酰基輔酶A。縮短的酰基輔酶A重新進入β-氧化循環，該過程可重復約5個循環，能去除10個碳原子，最后縮短至適當長度的酰基輔酶A可轉運至線粒體完成β-氧化［62］。在該氧化途徑中，ACOX1、L-PBE / MFP1和PTL三種基因都受到PPARα嚴格調控［63］。在非誘導過氧化物酶體β-氧化系統中，2-甲基-支鏈脂肪酰輔酶A為第一步反應的底物，可在非誘導型ACOX2作用下生成支鏈-脂酰輔酶A，支鏈-脂酰輔酶A通過D-PBE/ MFP2轉化為3-酮酰輔酶A，最后經具有硫解酶活性的 SCPx 分解［62］。

微粒體ω-氧化由PPARα調控的CYP4A酶進行調節。SFA、UFA在內質網中經ω-羥基化作用可生成ω-羥基脂肪酸，再經脫氫后可在胞質溶膠中產生有劇毒的二羧酸，二羧酸被轉化成二羧基輔酶A并進入過氧化物酶體誘導型β-氧化系統進一步代謝［64］。ω-氧化生成的二羧酸可以作為過氧化物酶體β-氧化體系的底物進行反應，也可以作為PPARα的配體，誘導PPARα活化進而調控肝臟內脂肪酸的3種主要氧化途徑。

3 PPARα在畜禽方面的研究進展

有關PPARs早期研究便證明其3種亞型主要作用于動物機體能量代謝方面，因此PPARα基因在畜牧學上現階段的研究主要集中于PPARα對畜禽能量代謝調控機理的探索，不同畜禽品種PPARα基因結構及分子特性的分析以及PPARα基因與畜禽部分經濟性狀相關性的探究。

3.1 對PPARα調控畜禽能量代謝機理的探索

近年來研究發現，PPARα的mRNA表達與畜禽動物能量代謝相關，可一定程度上調節畜禽機體的脂肪酸代謝及脂肪沉積等活動。陳興勇等［64］發現PPARα于皖西白鵝育肥20 d高表達，育肥30 d低表達（P＜0.000 1），且其表達量上升伴隨UFA/SFA含量上升，同時SFA含量下降，推測皖西白鵝PPARα基因的相對表達量與脂肪酸組成顯著相關，可作為脂肪酸性狀選育的候選基因［26］。林婄婄等［65］通過研究廣靈大尾羊和小尾寒羊兩種具有顯著尾型差異的綿羊發現，PPARα和PPARγ基因在不同月齡個體的幾種脂肪組織中mRNA均有表達，且淺層脂肪組織的表達量低于深層脂肪組織，二者在調節脂肪代謝方面的功能相反，但是存在協同作用。羅錦標等［66］研究發現在填飼前后朗德鵝的11種組織中，PPARα在除腹脂外其他10種組織中都有表達，較高表達于肝臟、腎臟等組織，填飼后發現其在腎臟中依然高表達，與PPARγ基因表達情況對比，證明PPARα與PPARγ表達模式并不一致，即PPARs亞型在不同組織的脂肪代謝調控中具有不同功能。賀綦等研究表明PPARα基因可顯著促進雞L-FABP基因的表達，進而調控脂肪酸的代謝活動［67］。徐凱等［68］通過檢測在馬身豬和大白豬不同月齡個體的肝臟內PPARα基因mRNA的表達量發現，這兩種不同脂肪型豬肝臟組織PPARα基因的mRNA呈規律性變化且存在差異，說明豬PPARα可能是肝臟脂質代謝的調控因子，可進一步調控豬脂肪沉積。饒遼源等檢測到山羊PPARα基因在腎臟和肝臟中表達量較高，在心臟中中度表達，在肺臟和脾臟中相對低表達，說明PPARα基因可能與體內脂肪氧化、脂質代謝和抗氧化應激等調控功能有關［9］。

3.2 對畜禽PPARα基因結構及分子特性的分析

有關畜禽PPARα基因結構及分子特性的分析研究表明，不同物種間PPARα基因結構存在差異，其蛋白結構也有所不同。馬云等［8］證明鴨PPARα基因核苷酸序列與所編碼氨基酸序列與雞、胸草雀、人、牛、家馬等均具有同源性，且其進化關系與雞最為密切，親緣關系最近。李彥瑩等［69］擴增出鴨PPARα啟動子序列，其長2 526 bp，存在典型的CAAT-box、TATA-box順式作用元件，預測存在特異性蛋白1（Specificity protein 1，Sp1）、核因子 κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB） 和 CCAAT增強子結合蛋白（CCAAT/enhancer bindingprotein alpha，C/EBP-α）轉錄因子結合位點。饒遼源等［9］擴增并克隆山羊PPARα基因CDS編碼區，其氨基酸序列與綿羊和牛同源性最高。馮秉仁等［10］發現豬PPARα基因與貓、犬親緣關系最近，可編碼468個氨基酸，平均分子質量為52.17 kD，為不穩定的親水蛋白，該蛋白不存在信號肽和跨膜結構域，包含9個潛在的O-糖基化位點和28個磷酸化位點二級結構由α螺旋、β轉角、延伸鏈和隨機卷曲組成，具有Zn-C4和HOLI兩個功能結構域，系統進化分析顯示。

3.3 與畜禽經濟性狀相關性的探究

在探究PPARα與畜禽部分經濟性狀相關性方面，大多為PPARα基因多態性與畜禽的生長性狀、脂肪性狀、肉質性狀、屠宰性狀等經濟性狀的關聯研究。武子寅等［70］檢測雞PPARα基因編碼區SNPs發現，雞PPARα基因編碼區630 bp處有一個C→T突變，形成CC、CT和TT三種基因型，且試驗雞群不同基因型個體間在失水率、系水力及肌內脂肪含量等肉質性狀上均出現顯著差異（P＜0.05），證明PPARα基因可能參與雞的糖脂代謝和能量代謝，可篩選為影響雞肉質性狀候選基因進行進一步研究。方文良等［71］通過擴增牛PPARα基因內含子3片段檢測出SNP位點44087（G/A），并發現中國荷斯坦奶牛PPARα基因44 087（G/A）位點普遍表現為GG基因型頻率最高，且GA基因型是優良基因型，其個體的體細胞評分（SCS）、乳蛋白率、耐熱指標等均優于GG基因型個體，因此44 087（G/A）位點GA基因型可作為中國荷斯坦奶牛的人工選擇依據，以降低奶牛熱應激危害，提高牛奶品質和產量。李芬等［72］以中國地方黃牛為對象研究發現，試驗牛PPARα基因第7外顯子164 bp處存在SNP（C/T），且該位點CC和CT兩種基因型個體之間在體斜長指標上有顯著差異（P＜0.05），表明該位點可能作為黃牛生長性狀輔助選擇指標之一。田亞東等［73］以安卡×固始雞F2資源群為試驗材料發現，PPARα基因外顯子存在SNP位點，且其多態性顯著影響雞腹脂重和腹脂率（P＜0.05），可以作為分子標記用于雞脂肪性狀的分子標記輔助選擇。

4 小結

隨著轉錄組、代謝組及蛋白組多組學技術水平的提高和生物信息學大數據的發展，傳統的畜牧研究已經逐漸深化到機體代謝過程中基因調控網絡以及分子互作影響，在畜禽脂質代謝方面的研究也借助高通量測序和多組學結合分析等手段從原始的種間差異研究過度到個體間基因調控的差異，并逐漸完善畜禽脂代謝過程各關鍵基因和分子的互作機制。PPARα基因作為肝臟脂質代謝調控的關鍵樞紐，在畜牧研究上進一步探究其基因功能以及完善其信號網絡，鑒定信號轉導過程所涉及的轉錄因子、靶基因、相關配體及輔佐因子的種類及作用，以及明確相關通路互作機制等仍需要進一步努力探究。研究PPARα基因及其信號通路調控畜禽肝脂代謝機制無疑可促進畜牧生產上與脂代謝相關經濟性狀的選擇，在畜牧生產應用方面有重要意義。