EDU脈沖追蹤小鼠心臟第二心場細胞遷移方法的優(yōu)化

袁白銀 劉鐘穎

（武漢科技大學生命科學與健康學院，武漢 430065）

先天性心臟缺陷是人類死亡率最高的疾病之一，影響約 1% 的新生兒［1］。30% 的人類先天性心臟缺陷是由流出道（Outflow tract，OFT）發(fā)育異常引起的［2-3］。OFT 和右室（Right ventricle，RV）是由第二心場（Second heart field，SHF）祖細胞發(fā)育而來的［4-5］。哺乳動物心臟主要是由第一心場（First heart field，F(xiàn)HF）和 SHF 組成的［6］。在心臟發(fā)育過程中，位于咽中胚層（Pharyngeal mesoderm，PM）和內(nèi)臟中胚層（Splanchnic Mesoderm，SpM）的 SHF細胞通過動脈極向 OFT 和 RV 遷移部署，通過靜脈極貢獻于心房心肌細胞［5，7］。SHF 祖細胞向 OFT 貢獻不足會使 OFT 延長受損，在人和小鼠中導致心室分割、動脈排列的缺陷，如雙出口右心室（Double outlet right ventricle，DORV），主動脈騎跨，大動脈轉(zhuǎn)位，肺動脈閉鎖和永存動脈干（Persistent truncus arteriosus，PTA）等［3，8-9］。迄今，許多學者在進行 SHF 祖細胞遷移部署的研究，并取得了一定的研究成果和進展，但是 SHF 祖細胞遷移部署的細胞生物學過程尚不清楚。因此，研究追蹤 SHF 細胞遷移部署的細胞生物學過程對于闡明哺乳動物心臟發(fā)育過程具有重要意義，將會為 SHF 發(fā)育缺陷提供新的視角。

現(xiàn)有標記追蹤 SHF 遷移部署的方法主要有胚胎顯微注射染料標記［3，10-11］和孕鼠注射染料標記［12-13］，前者對實驗者的操作及實驗條件要求相對較高。5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EDU）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞增殖時能夠插入正在復制的 DNA 分子中，基于 EDU 與染料的共軛反應可以進行高效快速的細胞增殖檢測分析。SHF 祖細胞在 SpM 處具有很強的增殖能力并不斷的向遠端 OFT 遷移，而遠端 OFT的 SHF 細胞并不具有增殖的能力［14］。根據(jù) SHF 祖細胞增殖和遷移的特性，在特定的時期通過向孕鼠脈沖注射 EDU 就能夠?qū)⑴咛?SpM 中處于增殖期的SHF 細胞進行有效的標記，而經(jīng)過一段時間的遷移，在 SpM 處被 EDU 脈沖標記的 SHF 細胞將遷移到達遠端 OFT，因此，根據(jù) EDU 標記細胞在 OFT 處的距離就可以追蹤 SHF 的遷移情況。Li［13］研究團隊報道，在胚胎發(fā)育的 9.25 d（E 9.25）采用 250 mg（相當于 10 mg/kg 劑量）EDU 的劑量腹腔注射孕鼠，在注射 EDU 2 h 后，采用腹腔注射 EDU 的類似物胸苷嘧啶核苷（Thymidine）終止 EDU 的作用，于 15 h后檢測被 EDU 標記的 SHF 細胞的遷移情況。本研究采用該報道的劑量進行 EDU 標記和追蹤發(fā)現(xiàn)，大部分胚胎不能被 EDU 有效的標記。

在文獻報道的基礎上，通過優(yōu)化劑量和標記時間來改良 EDU 脈沖標記追蹤 SHF 細胞遷移部署的實驗方法。結(jié)果顯示，采用 40 mg/kg 劑量和 2 h 的標記時間，在所有檢測的胚胎中，SHF 細胞都被有效標記，且與 10 mg/kg 劑量相比，在 SpM 處 EDU標記細胞的數(shù)量明顯增加。在此條件下，通過 19 h的追蹤，EDU 標記的 SHF 細胞遷移進入遠端 OFT。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與 10 mg/kg 的劑量相比，采用 40 mg/kg 劑量顯著地增加遠端 OFT 處 EDU 陽性細胞的百分率；而在兩種劑量下，EDU 陽性細胞遷移進入遠端 OFT 的距離并沒有差異。同時發(fā)現(xiàn)，在 40 mg/kg 劑量條件下，2 h 和 4 h 的標記時間對 EDU 標記效率以及 EDU 標記細胞向 OFT 的遷移距離并沒有差異。總之，通過優(yōu)化 EDU 的劑量和標記時間，本研究擬提供一種有效、方便的追蹤 SHF 遷移部署的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J 小鼠購自南京大學模式動物研究所，EDU 及染色試劑盒購于 Invitrogen 公司（C10338），DAPI 購于生工生物工程（上海）有限公司（6584）。

1.2 方法

1.2.1 EDU 和胸苷嘧啶核苷腹腔注射 實驗前1 d將成年雄鼠和雌鼠合籠，第2天上午檢栓，將該天見栓受孕的孕鼠標記為 E 0.5（胚胎發(fā)育第 0.5 d）。按照文獻報道，在 E 9.25 時，腹腔注射給予孕鼠一定劑量的 EDU，在注射 EDU 2 h 后，給予孕鼠 10倍劑量的 EDU 類似物胸苷嘧啶核苷終止 EDU 作用。追蹤 19 h 后處死孕鼠，收獲胚胎（約為 E 10.0）。將收獲的胚胎進行連續(xù)石蠟切片和后續(xù)的 EDU 檢測。EDU 粉末用滅菌的 PBS 配成濃度為 2.5 mg/mL（10 mmol/L）的原液，原液用 PBS 稀釋為 1 mg/mL 的工作濃度使用；胸苷嘧啶核苷用滅菌的雙蒸水配成48.5 mg/mL 原液，原液用雙蒸水稀釋使用。所有操作均在遵守并符合實驗動物福利及動物管理等相關條例的條件下進行，本研究得到了南京大學模式動物研究所倫理委員會的批準。

1.2.2 胚胎的固定、脫水、包埋、切片 （1）頸椎脫臼處死孕鼠，于預冷 PBS 中小心分離胚胎；（2）4%多聚甲醛固定胚胎 2 h；（3）PBS 清洗 2 次，每次 5 min；（4）梯度乙醇脫水：30% 乙醇，15 min→50%乙醇，15 min→70% 乙醇，15 min→85% 乙醇，15 min→95% 乙醇，15 min；（5）正丁醇透明 3 次，每次 10 min；（6）65℃ 透蠟 1 h，中間換蠟 2-3 次；（7）將胚胎組織進行石蠟包埋；（8）石蠟包埋胚胎進行連續(xù)切片，厚度 5 μm；（9）胚胎石蠟切片進行 EDU染色。

1.2.3 EDU檢測 （1）石蠟組織切片復水：二甲苯3 次，每次 10 min→梯度乙醇復水（100% 乙醇，2 min→95% 乙醇，2 min→85% 乙醇，2 min→70%乙醇，2 min→50% 乙醇，2 min→ H2O，2 min）；（2）2 mg/mL 甘氨酸清洗 10 min ；（3）0.5% TritonX-100（PBST） 通 透 20 min；（4）PBS 清 洗 5 min；（5）EDU 染色混合液室溫避光孵育 1 h，染色混合液成分 如 下 ：1×Click-iT EdU reaction buffer：430 μL，10×Click-iT EdU buffer additive ：50 μL，CuSO4（10 mmol/L）：20 μL，Alexa Fluor 555 azide ：1.2 μL ；（6）0.5% Tritonx-100 in 1×PBS 清洗 2-3 次，每次 10 min；（7）甲醇清洗 1-2 次，每次 5 min；（8）PBS清洗 5 min；（9）DAPI 工作液室溫避光孵育 30 min；（10）封片，leica 激光共聚焦顯微鏡下熒光成像。

1.2.4 結(jié)果統(tǒng)計分析 使用 ImageJ 軟件統(tǒng)計分析EDU 遷移的距離以及 EDU 陽性細胞的百分率，將胚胎中包含 OFT 及 SpM 的部位進行石蠟切片，對每只胚胎 OFT 及 SpM 連續(xù)切片的染色結(jié)果進行測量。使用 Graphpad 6.0 對測量結(jié)果進行統(tǒng)計分析。*代表P＜ 0.05，**代表P＜ 0.01，***代表P＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 10 mg/kg劑量EDU顯示較差的標記效果

首先給予孕鼠 10 mg/kg 的 EDU（文獻報道的劑量），2 h 后注射 100 mg/kg的胸苷嘧啶核苷終止EDU 作用；19 h 后處死孕鼠，收獲 E 10.0 胚胎并進行連續(xù)石蠟切片和后續(xù)的 EDU 檢測。同時為了更好的分析 EDU 標記結(jié)果，選取孕鼠的小腸組織檢測EDU 的標記情況（存在大量增殖的細胞）。

結(jié)果（圖 1）發(fā)現(xiàn)，所有孕鼠的小腸組織都能被 EDU 有效的標記；在我們由 4 只孕鼠獲得的 22枚胚胎中，只有 10 枚（50%）胚胎被 EDU 有效標記，在另外超過 50% 的胚胎中，大部分胚胎沒有 EDU標記的細胞，一部分胚胎有極少量的細胞被 EDU標記；且由同一孕鼠獲取的胚胎中，有些胚胎能被EDU 標記，有些卻未被標記。以上結(jié)果顯示，采用文獻報道 10 mg/kg 劑量的 EDU，可以對孕鼠組織進行有效的標記，但對胚胎的標記效果較差。

圖 1 10 mg/kg 劑量 EDU 在胚胎中的標記效果

2.2 采用40 mg/kg劑量的EDU可對胚胎進行有效的標記

10 mg/kg 劑量的 EDU 可對孕鼠組織進行有效標記，而胚胎則不能進行有效標記。我們推測可能因為胚胎存在胎盤屏障，相對于孕鼠自身的組織，劑量過小的 EDU 較難滲透到胚胎組織中。因此，我們將 EDU 劑量增加至 40 mg/kg，并采用 400 mg/kg 劑量的胸苷嘧啶核苷終止 EDU 標記。

為了檢測該劑量的 EDU 和胸苷嘧啶核苷是否對孕鼠及胚胎產(chǎn)生毒性，將注射 EDU 和胸苷嘧啶核苷的孕鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些孕鼠是可以正常產(chǎn)仔，且產(chǎn)下的小崽與正常小崽并沒有區(qū)別。在分離胚胎過程中分析觀察孕鼠的形態(tài)、內(nèi)臟器官，以及胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果（圖 2）顯示，該劑量的 EDU 和胸苷嘧啶核苷沒有影響孕鼠和胚胎的正常機能和發(fā)育，不會對孕鼠和胚胎造成毒性；且由 6 只孕鼠獲取的 31 只胚胎均被 EDU 有效標記，在胚胎中出現(xiàn)大量 EDU 陽性的 SHF 細胞，且 EDU 標記的 SHF 細胞已經(jīng)遷移進入遠端 OFT。

檢測 EDU 在 SpM 處對 SHF 祖細胞的標記區(qū)域及標記百分率（在 SpM 處，EDU 陽性細胞占 SpM處所有細胞的百分率）。結(jié)果（圖 3）顯示，EDU 標記的 SHF 細胞只存在于 SpM，沒有出現(xiàn)在 OFT 區(qū)域；胚胎連續(xù)切片 EDU 檢測和統(tǒng)計分析結(jié)果表明，SpM處 EDU 陽性細胞約占整個 SpM 細胞的 53%。以上結(jié)果說明，采用 40 mg/kg 的劑量屬于安全劑量，且對胚胎的 SHF 細胞能夠進行有效的標記。

圖 2 E 10.0，胚胎中EDU的標記情況

A-A’：E 9.25，胚胎中 EDU 標記 SHF 細胞的分布 ；B ：E 9.25，SpM 處 EDU陽性細胞的百分率。白色虛線標識的是 SpM 部位，紅色虛線標識的是 OFT部位。標尺= 50 μm

2.3 評估劑量對追蹤SHF細胞遷移的效果

為評估劑量對追蹤 SHF 細胞遷移的效果，我們將 40 mg/kg 和 10 mg/kg 兩種劑量的效果進行對比分析。由于采用 10 mg/kg 劑量對胚胎的標記效率較低，通過增加孕鼠數(shù)量來增加被有效標記的胚胎數(shù)量。

統(tǒng)計分析 EDU 陽性細胞遷移進入 OFT 處的距離，以及 EDU 陽性細胞在遠端 OFT 遷移距離中EDU 陽性細胞的百分率（以下簡稱 OFT 處 EDU 陽性細胞百分率）。結(jié)果（圖 4）顯示，兩種劑量對EDU 陽性 SHF 細胞在遠端 OFT 的遷移距離沒有差別；相比 10 mg/kg 劑量（OFT 處 EDU 陽性細胞百分率為 31%），40 mg/kg 劑量標記的胚胎中，OFT 處EDU 陽性細胞的百分率有了顯著性提高（54%），且OFT 處 EDU 陽性細胞的百分率與 E 9.25 時 SpM 處EDU 陽性細胞百分率一致。

以上結(jié)果表明，采用 40 mg/kg 劑量的 EDU 脈沖標記能夠真實、有效地追蹤 SHF 細胞向 OFT 遷移。

圖 4 劑量對追蹤 SHF 細胞遷移的影響

2.4 評估EDU脈沖標記時間的影響

為了檢測 EDU 標記時間對標記效率及細胞遷移的影響，在 40 mg/kg EDU 劑量條件下，分析比較 2 h 和 4 h 的標記效率。由于 E 10.0 時 OFT 處 EDU 陽性細胞的百分率與 E 9.25 時 SpM 處 EDU 陽性細胞百分率一致，這里用 E 10.0 處 EDU 陽性細胞的百分率分析 EDU 的標記效率。

注射 EDU，分別在 2 h 和 4 h 給予 400 mg/kg 胸苷嘧啶核苷終止標記，19 h 后收獲 E 10.0 胚胎，分析統(tǒng)計 OFT 處 EDU 陽性 SHF 細胞的百分率和遷移距離。結(jié)果（圖 5）顯示，4 h EDU 標記時間與 2 h EDU 標記時間，在 OFT 處 EDU 陽性 SHF 細胞的百分率和遷移距離中沒有表現(xiàn)出差異。說明 2 h 標記時間即可將 SpM 處增殖的 SHF 進行充分有效的標記。考慮到 4 h 的標記可能會對細胞遷移產(chǎn)生一定的影響，采用 2 h 的 EDU 標記時間具有一定的優(yōu)勢。

圖 5 EDU 標記時間的影響

3 討論

先天性心臟缺陷中約有 30% 是由于 OFT 發(fā)育缺陷引起的。OFT 和 RV 是由第二心場祖細胞貢獻發(fā)育而來的，SHF 祖細胞發(fā)育缺陷將引起動脈及對應心室排列、動脈分隔的缺陷，在人和小鼠中導致DORV、大動脈轉(zhuǎn)位、PTA 等心臟發(fā)育的異常。迄今為止，SHF 祖細胞向 OFT 遷移、部署的細胞生物學過程仍是尚未闡明清楚的問題，也是目前很多科學工作者正在研究攻克的方向。目前，研究 SHF 遷移、部署過程所采用的實驗方法有胚胎顯微注射染料并結(jié)合胚胎體外培養(yǎng)［3，10］、胚胎厚切片培養(yǎng)結(jié)合雙光子顯微成像系統(tǒng)［15］、孕鼠腹腔注射 EDU 脈沖標記結(jié)合石蠟切片免疫熒光染色技術［12-13］等。前兩種方法對實驗條件、操作環(huán)境、儀器設備及實驗人員的操作等均有很高的要求和難度，需要配套有相應的實驗條件和設備，給實驗的實施帶來了很大的挑戰(zhàn)。而 EDU 脈沖標記是通過將 EDU 腹腔注射孕鼠，EDU 摻入處于細胞增殖 S 期正在復制的 DNA分子中，基于 EDU 與染料的共軛反應可以對 EDU進行簡單、快速、準確的檢測，實驗操作簡單，對操作人員的技術、實驗設備和條件要求不高。因此，EDU 脈沖標記追蹤 SHF 細胞的遷移部署過程具有很強的實施性和操作性。

本研究在使用文獻報道的方法進行 EDU 脈沖標記追蹤 SHF 細胞的遷移過程中發(fā)現(xiàn)，EDU 不能將胚胎中處于增殖期的細胞進行有效的標記。在此基礎上，通過調(diào)整 EDU 的劑量及標記時間，我們探索并優(yōu)化出標記追蹤 SHF 細胞遷移的有效方法：給予孕鼠腹腔注射 40 mg/kg 劑量的 EDU，標記 2 h 后，腹腔注射給予 400 mg/kg 的胸苷嘧啶核苷終止 EDU標記，繼續(xù)追蹤 19 h 可在遠端 OFT 處觀察到大量EDU 陽性的細胞。

4 結(jié)論

本實驗優(yōu)化了EDU脈沖標記追蹤 SHF 細胞遷移部署的方法，在對孕鼠和胚胎不產(chǎn)生毒性的前提下，顯著提高 EDU 在胚胎中的標記效果以及在 SHF細胞的標記效率，提供了一種有效、方便的追蹤SHF 遷移部署的方法。